Как корова помогает биотопливу: обнаружено почти 30 000 новых ферментов
Коровы питаются травой — факт, известный тысячелетиями. Из этого волокнистого рациона, состоящего в основном из трудноразлагаемых компонентов клеточных стенок растений — целлюлозы и гемицеллюлозы, — жвачные животные извлекают всё необходимое для питания. Теперь же корова, а точнее, сообщество микроорганизмов, обитающих в её рубце (первом отделе желудка), предоставило исследователям важные данные, которые могут ускорить широкое внедрение биотоплив. Это даёт доступ к изучению большой категории микробов, которые ранее не поддавались культивированию в лаборатории.
С помощью масштабного секвенирования ДНК исследователи из Объединённого института генома (JGI) Министерства энергетики США (DOE) и Института энергетической биологии (EBI) охарактеризовали гены и геномы растительно-переваривающих микробов, выделенных из рубца коровы. Результаты опубликованы 28 января в журнале Science. Одна из проблем создания биотоплива из растений — высокая стоимость и энергозатраты на предварительную обработку биомассы для её преобразования в сахара, а затем в топливо.
«Микробы эволюционировали миллионы лет, чтобы эффективно разлагать устойчивую биомассу, — сказал директор JGI и руководитель исследования Эдди Рубин. — Сообщества таких организмов встречаются в различных экосистемах: в рубце коров, кишечнике термитов, компостных кучах, на лесной подстилке. Микробы решили эту задачу, преодолев защитный барьер растений, чтобы получить доступ к питательным веществам — богатому источнику энергии».
Считается, что крупный рогатый скот появился миллионы лет назад и был одомашнен около 10 000 лет назад. Микробы рубца эволюционировали, чтобы производить молекулярные машины — ферменты, способные эффективно расщеплять полисахариды клеточных стенок растений, такие как целлюлоза и гемицеллюлоза, на составляющие их простые сахара. Иными словами, в обмен на «жильё» в рубце микробы «платят аренду», преобразуя клетчатку, которую корова не может использовать, в малые сахарные молекулы. Эти молекулы затем ферментируются в продукты, дающие энергию корове.
Это исследование позволило учёным JGI и их коллегам в масштабе, в тысячи раз превышающем предыдущие работы, изучить ферментативный потенциал, закодированный в геномах ранее не охарактеризованных микробов рубца. Это углубило понимание почти 30 000 генов, кодирующих ферменты, которые могут обладать мощной способностью разлагать биомассу на простые сахара — важнейший первый этап производства целлюлозного биотоплива.
«Промышленность ищет лучшие способы расщепления биомассы для использования в качестве сырья для нового поколения возобновляемого биотоплива, — отметил Эдди Рубин. — Вместе с коллегами мы изучаем молекулярные механизмы, которые микробы в корове используют для разложения растительного материала».
Лишь около 1% микробных видов планеты можно легко выращивать в лаборатории; подавляющее большинство — в почве, воде и внутри других крупных организмов, таких как коровы, — не культивируется. Такие «метагеномные» исследования, как это, предоставляют альтернативный метод анализа.
Постдоки Рубина Маттиас Хесс и Алекс Шчирба использовали одну из самых перспективных крупномасштабных биоэнергетических культур — просо прутьевидное (Panicum virgatum) — и позволили микробным симбионтам коровы из преджелудка сделать своё дело. Для лучшего контроля процесса Хесс и его коллеги из Иллинойсского университета работали с фистулированной коровой — моделью, которая для научных исследований позволяет получить прямой доступ через трубку в рубец. Образцы проса помещали в нейлоновые мешки, которые затем вставляли в рубец коровы, где их оставляли для переваривания. Через 72 часа мешки извлекали, а ДНК микробов, участвовавших в переваривании и прикрепившихся к просу, выделяли и секвенировали.
Объём данных, сгенерированных для этого исследования микробов рубца, составил 270 миллиардов «букв» генетического кода — примерно в 100 раз больше, чем количество букв во всём геноме человека. «Настоящей проблемой был анализ огромного массива данных, для которого не было доступных референсных геномов, а также идентификация и получение полноразмерных функциональных ферментов на основе информации, полученной из миллиардов коротких фрагментов последовательностей ДНК», — пояснил Хесс.
Для анализа информации исследователи разработали стратегию сборки геномов, способную обработать огромный объём данных, избегая ошибок сборки, которые привели бы к появлению химер — искусственных генов, отсутствующих в микробном сообществе. «Представьте, что кто-то смешал сотни пазлов с миллионами деталей каждый в одну большую кучу, — сказал Шчирба. — Мы попытались собрать как можно больше из них, совершив как можно меньше ошибок. Это непростая задача. Нужна хорошая стратегия и много вычислительных ресурсов».
Применяя различные фильтры, Шчирба сократил количество из более чем двух миллионов предсказанных генов до 27 755 генов-кандидатов, кодирующих определённую категорию ферментов — углеводно-активные ферменты (CAZymes). Эти ферменты могут расщеплять растительные полисахариды (например, целлюлозу) на малые сахара. Хесс идентифицировал наиболее перспективных кандидатов, протестировал подмножество из 90 генов на функциональность и обнаружил, что более 50% протестированных кандидатов обладают целлюлозо-разрушающей активностью, а почти 20% способны расщеплять «реальную» биоэнергетическую культуру — просо прутьевидное. Это показало команде, что значительная часть из 30 000 идентифицированных генов действительно активна против растительного материала и станет сокровищницей новых ферментов для исследователей биотоплива. Хесс отметил, что открытие этих новых ферментов в одном этом исследовании увеличило количество известных ферментов, действующих на углеводы, почти на треть по сравнению с многочисленными предыдущими исследованиями, проводившимися десятилетиями.
Помимо идентификации генов, кодирующих ферменты, которые могут сыграть важную роль в будущих промышленных процессах производства лигноцеллюлозного биотоплива, Хесс и Шчирба хотели собрать не только гены, но и полные геномы организмов, участвующих в разложении биомассы из рубца. Используя различные вычислительные подходы, им удалось построить 15 геномов микробов рубца, ни один из которых не соответствовал ранее описанным.
Чтобы подтвердить свои вычислительные результаты, команда обратилась к другому методу изучения геномов микробов, также не требующему культивирования: геномике одиночных клеток. Они смогли выделить одну микробную клетку из рубца с помощью клеточного сортера и, не выращивая её, получили геном этого некультивируемого микроба с помощью технологии секвенирования одиночных клеток. Когда последовательности ДНК, полученные из генома одиночной клетки, сопоставили с 15 вычислительно собранными геномами, исследователи обнаружили, что более 98% данных соответствуют одному конкретному геному, собранному in silico. «Данные по одиночной клетке убедили нас, что то, что мы видели, реально, — сказал Хесс. — Иначе у нас были бы только вычислительные данные, что сделало бы нашу работу гораздо менее убедительной».
Эта новаторская работа, проведённая JGI и его сотрудниками, показывает, что с помощью крупномасштабных возможностей секвенирования в сочетании с масштабным анализом данных, вычислительными мощностями и передовой геномикой одиночных клеток нового поколения исследователи теперь могут изучать широкий спектр целлюлозо-разрушающих ферментов из новых микробов, не будучи привязанными к возможности выращивать их в культуре. Это может сократить обширное пространство «микробной тёмной материи», которое до сих пор было трудно исследовать. Кроме того, использованный здесь подход может быть легко расширен для поиска других микробных ферментов, имеющих значение для других миссий DOE.