Реакция агглютинации (РА)

Реакция агглютинации (РА) — это лабораторный метод выявления и количественного определения антигенов (Аг) и антител (Ат), основанный на их способности к специфическому связыванию с образованием видимых невооружённым глазом скоплений (агломератов).

В диагностике инфекционных болезней и других целях РА применяется для:

Принцип метода основан на высокой специфичности взаимодействия «антиген — антитело» и сводится к нахождению известного компонента по неизвестному. Существует множество вариантов постановки реакции:

  • По цели: количественные и качественные.
  • По технике: пробирочные и на стекле.
  • По объёму: объёмные и капельные.
  • По скорости: обычные, ускоренные и экспресс-методы.

Компоненты, необходимые для постановки РА

  1. Сыворотка крови.

  2. Антиген (диагностикум).

    • При определении типа антител используют стандартные производственные диагностикумы (взвесь известных убитых бактерий).
    • При определении антигена диагностикум готовят самостоятельно. Обычно это взвесь исследуемого микроба концентрацией 1–3 млрд клеток на 1 мл физиологического раствора. Культуру (чаще 18–20-часовую агаровую, реже бульонную) инактивируют:
      • Прогреванием на водяной бане при 70 °C в течение 1 часа.
      • Или инкубацией в течение 24 часов при 37 °C с формалином (конечная концентрация 0,2%).

  3. Электролит. Используется изотонический раствор хлорида натрия (0,9%, физраствор).

Техника постановки объёмной серийной пробирочной РА (для определения титра антител)

  1. Приготовление рабочих разведений сыворотки.

    • Из основного разведения сыворотки готовят несколько рядов последовательных двукратных разведений. Количество рядов равно количеству используемых диагностикумов.
    • В каждом ряду должно быть как минимум разведение, соответствующее диагностическому титру, два разведения ниже и два разведения выше него.
    • Пример: если диагностический титр равен 1:100, готовят разведения: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400. При капельном методе первое разведение (1:25) можно опустить, но добавляют более высокое — 1:800.
    • В научных исследованиях титрование проводят до получения отрицательной реакции.

  2. Процедура разведения (на примере объёма 0,5 мл):

    • Во все пробирки, кроме первой, наливают по 0,25 мл физраствора.
    • В первую и вторую пробирки вносят по 0,25 мл основного разведения сыворотки.
    • Из второй пробирки 0,25 мл переносят в третью, перемешивают, затем из третьей — в четвёртую и так далее до последней. Из последней пробирки 0,25 мл удаляют для уравнивания объёмов.
    • Для каждого нового ряда разведений или диагностикума используют отдельную пипетку.

  3. Добавление антигена и контроли.

    • В каждое разведение сыворотки добавляют диагностикум в объёме, равном объёму сыворотки в пробирке (например, по 0,25 мл). Это увеличивает конечное разведение сыворотки в каждой пробирке в 2 раза.
    • Обязательно ставят контроли:
      • Контроль сыворотки: основное разведение сыворотки + физраствор.
      • Контроль антигена: диагностикум + физраствор (для каждого диагностикума свой контроль).

  4. Инкубация и учёт.

    • Штатив с пробирками встряхивают и помещают в термостат при 37 °C на 4 часа, затем оставляют при комнатной температуре до следующего дня.
    • Учёт реакции проводят, оценивая количество осадка и степень просветления надосадочной жидкости. Оценку проводят невооружённым глазом на тёмном фоне, в агглютиноскопе или над зеркалом микроскопа.
    • Контроли должны быть: сыворотка — прозрачная; антиген — равномерно мутный (после встряхивания).

Оценка интенсивности реакции и определение титра

Интенсивность агглютинации обозначают знаками «+» (плюс):

  • ++++ — большой хлопьевидный осадок, жидкость полностью просветлена.
  • +++ — большой осадок, жидкость не полностью просветлена.
  • ++ — заметный осадок, заметное просветление жидкости.
  • + — слабая агглютинация, лёгкая опалесценция жидкости.
  • – — отсутствие агглютинации (равномерная муть, как в контроле антигена).

Титром антител считают наибольшее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация интенсивностью не менее ++.

Интерпретация результатов (сравнение с диагностическим титром)

  • Титр сыворотки в 2 раза ниже диагностического — реакция сомнительная.
  • Титр равен диагностическому — реакция слабоположительная.
  • Титр в 2–4 раза выше диагностического — реакция положительная.
  • Титр в 8 и более раз выше диагностического — реакция резко положительная.

При широкой распространённости антител среди здорового населения (например, при брюшном тифе) более информативным является не абсолютный титр, а нарастание титра антител в парных сыворотках, взятых с интервалом в 7–10 дней.

Постановка РА для определения вида антигена (идентификации микроба)

Принцип обратный: известный компонент — диагностические сыворотки, неизвестный — исследуемая культура.

  • Количество рядов разведений соответствует количеству взятых диагностических сывороток.
  • Готовят ряд разведений каждой диагностической сыворотки, включая разведение, равное её титру, а также в 2, 4, 8 раз ниже.
  • Пример: если титр сыворотки 1:3200, используют разведения: 1:3200, 1:1600, 1:800, 1:400, 1:200.
  • К разведениям добавляют равный объём исследуемой взвеси бактерий (антигена).
  • Ставят контроли сыворотки и антигена для каждой сыворотки.

Оценка: чтобы сделать вывод о соответствии исследуемого микроба взятой сыворотке, титр реакции должен быть не менее половины титра стандартной диагностической сыворотки. Реакции в титрах 1:4 и ниже обычно рассматривают как групповые (перекрёстные).

Особенности капельного метода

Отличается от объёмного:

  • Сыворотку разводят в объёме 1 мл.
  • Антиген используют в более высокой концентрации (около 10 млрд/мл), добавляя по 1–2 капли в пробирку.
  • Разведение сыворотки после внесения антигена считается неизменным.
  • Методика постановки, учёта и оценки в остальном аналогична объёмному методу.

Современный контекст

Реакция агглютинации, описанная в классическом виде, стала основой для множества современных, более чувствительных и автоматизированных методик. Сегодня её принципы используются в:

  • Реакции пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА, РНГА): где антиген или антитело предварительно сорбируются на поверхности эритроцитов или других частиц (латекса, золота), что многократно увеличивает чувствительность и наглядность теста. Именно в формате РПГА часто проводятся, например, серологические тесты на сифилис.
  • Иммунохроматографических экспресс-тестах (латеральный поток): которые применяются для быстрой диагностики инфекций (грипп, COVID-19, стрептококковая ангина), беременности и т.д. В основе их работы также лежит принцип специфической агглютинации окрашенных наночастиц.
  • Автоматических иммуноанализаторах: где процесс агглютинации и его учёт (по изменению светорассеяния или турбидиметрии) полностью автоматизированы, что позволяет быстро обрабатывать большое количество проб с высокой точностью.

Таким образом, классическая РА остаётся фундаментальным методом иммунологии, хотя в чистом виде в крупных лабораториях её всё чаще заменяют более современными и удобными модификациями.