Секвенирование РНК отдельных клеток для изучения сальмонеллёзной инфекции
Вспышки инфекций, вызываемых Salmonella enterica, остаются серьёзной проблемой. Патоген, вторгаясь в кишечник, вызывает заболевание с широким спектром симптомов — от диареи и лихорадки до бессимптомного течения. Исход инфекции зависит от множества факторов, включая различия в штаммах бактерий, генетике и иммунном ответе хозяина. Это создаёт значительную гетерогенность как среди клеток патогена, так и среди клеток хозяина.
Разрешение отдельных клеток с помощью секвенирования РНК
Для изучения этой сложной гетерогенности во взаимодействиях хозяина и сальмонеллы учёные применяют методы с высоким разрешением. «Это очень сложно изучать, поскольку количество бактерий на разных стадиях инфекции невелико. Нам нужны чувствительные инструменты для их исследования», — отметил профессор Рои Авраам (Институт науки Вейцмана) на конференции ASM Microbe 2022.
Одним из таких инструментов является секвенирование РНК отдельных клеток (scRNA-seq). В отличие от традиционного «общего» RNA-seq, который показывает усреднённый транскриптом образца, scRNA-seq предоставляет информацию об экспрессии генов в каждой отдельной клетке, открывая высокое пространственно-временное представление о ландшафте инфекции.
Клеточная гетерогенность во время инфекции сальмонеллой
Salmonella enterica серовар Typhimurium (S. Typhi) вторгается в клетки кишечника и начинает внутриклеточный жизненный цикл внутри фагоцитов, таких как макрофаги. Известно, что S. Typhi имеет гетерогенные скорости репликации внутри макрофагов и тканей:
- Быстрорастущая субпопуляция: производит эффекторные белки вирулентности с помощью систем секреции III типа (T3SS), расположенных на Островках Патогенности Сальмонеллы (SPI) 1 и 2. Эти белки захватывают клеточные механизмы хозяина для выживания патогена.
- Субпопуляция персистеров: клетки, которые не размножаются, но метаболически активны. Они устойчивы ко многим антибиотикам и могут служить резервуаром для хронических инфекций.
scRNA-seq макрофагов, инфицированных S. Typhi, показал:
- Активно делящиеся сальмонеллы находятся преимущественно в M2-подобных макрофагах (противовоспалительных, поддерживающих рост бактерий).
- Нереплицирующиеся сальмонеллы-персистеры находятся преимущественно в M1-подобных макрофагах (провоспалительных, останавливающих рост бактерий).
Персистеры, хотя и составляют меньшую субпопуляцию, клинически значимы. При отмене антибиотиков они могут вызывать рецидив болезни, поскольку, оставаясь метаболически активными, способны репрограммировать макрофаги с помощью эффекторов вирулентности SPI-2.
Исследования двойного RNA-seq для системы хозяин-сальмонелла
Исследователи разрабатывают подход двойного RNA-seq (dual RNA-seq) для одновременной оценки клеток хозяина и патогена. Применение «общего» dual RNA-seq показало, что бактериальная малая РНК PinT манипулирует экспрессией многих генов хозяина и бактерии:
- У хозяина: PinT повышает экспрессию генов, вовлечённых в воспалительную сигнализацию в кишечнике, что помогает сальмонелле конкурировать с микробиотой.
- У бактерии: PinT снижает экспрессию некоторых эффекторов вирулентности SPI-1 и SPI-2.
На конференции ASM Microbe 2022 профессор Авраам представил технику scPAIR-seq, позволяющую анализировать специфические иммунные ответы на патоген с разрешением на уровне одной клетки. В этом исследовании макрофаги инфицировали библиотекой меченых бактерий с мутациями в эффекторах SPI-2.
Ключевой результат: среди эффекторов вирулентности наибольшее влияние на транскриптом хозяина оказал белок SifA. Обычно SifA помогает сальмонелле создать защищённую нишу внутри вакуолей макрофагов. В его отсутствие S. Typhi находится в цитоплазме и репрограммирует инфицированные макрофаги в противовоспалительное M2-состояние, что позволяет бактериям пролиферировать в цитозоле. Это указывает на альтернативный путь инфекции.
Применение scRNA-seq и перспективы
Методы scRNA-seq становятся популярным выбором для анализа изменений в экспрессии генов при взаимодействии хозяина и патогена. Они раскрывают молекулярные детали того, как иммунные клетки устраняют патогены, и эффективность различных противомикробных терапий.
Усилия по созданию клеточных атласов, такие как Immunological Genome Project (профили экспрессии генов всех иммунных клеток мыши), помогут понять, какие гены модулируются в разных типах иммунных клеток во время бактериальных инфекций.
Учёные также пытаются перевести результаты RNA-seq из лаборатории в клинику. В одном из исследований алгоритм на основе данных scRNA-seq использовали для предсказания исходов сальмонеллёзной инфекции ex vivo по образцам крови здоровых людей. Индивидуумы с разными типами иммунных клеток (например, с полиморфизмом в гене TLR10) демонстрировали разные фенотипы инфекции. Анализ гетерогенности на клеточном уровне в будущем может помочь в разработке персонализированных терапий.