Защита страны от заразных болезней животных

Смертельный вирус животных распространяется по России и приближается к Восточной Европе и Азии. После появления в Грузии и на Кавказе в 2007 году и распространения в России, вирус африканской чумы свиней (АЧС) был впервые обнаружен в прошлом году в Украине, что вызвало высокую тревогу в европейских и азиатских странах. Вирус действует быстро, убивая 100% зараженных свиней в течение недели в некоторых случаях.

На пути возможного вторжения в США заразных болезней животных, таких как АЧС, стоит Центр по изучению болезней животных на острове Плам, расположенный у северо-восточной оконечности Лонг-Айленда, Нью-Йорк. Почти 60 лет центр служит своего рода крепостью, где небольшая группа ученых борется с опасными заболеваниями, угрожающими здоровью скота и мировой экономике.

В 1954 году Служба сельскохозяйственных исследований Минсельхоза США (ARS) взяла остров Плам у армии США для создания лабораторий, где ученые могли бы найти способы предотвращения и контроля экзотических болезней, угрожающих животноводству США и глобальной продовольственной безопасности. Основной целью была разработка методов обнаружения и предотвращения ящура — экономически разрушительного заболевания. Ящур был искоренен в США в 1929 году, но сегодня он распространяется по Азии и Африке. Недавние вспышки произошли в Великобритании, Болгарии, Японии и Южной Корее.

Ученые подразделения ARS по исследованию заразных болезней животных (FADRU) на острове Плам, работая с другими агентствами, также сдерживают такие болезни, как АЧС, классическая чума свиней и везикулярный стоматит. В 1984 году команда Службы инспекции здоровья животных и растений USDA (APHIS) взяла на себя диагностическую работу, оставив фундаментальные исследования ученым ARS. Еще одно изменение произошло в 2003 году, когда управление островом Плам было передано Министерству внутренней безопасности США (DHS), которое работает с USDA над продвинутой разработкой вакцин и диагностических тестов для контроля и реагирования на вспышки болезней.

Отслеживание ящура: место заражения

Центр на острове Плам обеспечивает безопасные условия для изучения ящура, который поражает парнокопытных животных, таких как крупный рогатый скот, свиньи, овцы, козы и олени. Высококонтагиозное заболевание редко смертельно для взрослых животных, но ослабляет жертв и может вызвать массовую гибель молодняка. Вспышки ящура имеют серьезные экономические последствия из-за изоляции от торговли, потери производства молока, тяжелой хромоты и массового уничтожения животных. Когда вирус проникал в страны, свободные от ящура, миллионы животных — зараженных и незараженных — подвергались эвтаназии после вспышек, чтобы предотвратить распространение вируса.

Прорыв в исследованиях ящура произошел в 2010 году, когда ветеринарный офицер Джонатан Арцт определил место, где вирус ящура инициирует заражение у крупного рогатого скота. Работая с руководителем исследований FADRU Луисом Родригесом и микробиологом Хуаном Пачеко, Арцт обнаружил, что вирус избирательно заражает эпителиальные клетки в задней части горла коровы.

"Теперь, когда мы определили фактический путь, который вирус проходит у зараженного скота, мы можем попытаться разработать новые вакцины и биопрепараты для воздействия и предотвращения заражения вирусом первичного места и потенциально контролировать и искоренять ящур", — говорит Арцт. — "Блокировка начального места заражения — лучший способ достичь полной защиты".

Существует семь серотипов вируса ящура — O, A, C, Asia-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. Ученые обнаружили место заражения с помощью серотипа O и с тех пор добились такого же успеха с серотипом A.

Работа также включает помощь в создании инфраструктуры для тестирования, мер биобезопасности и идентификации штаммов вируса ящура во Вьетнаме и Пакистане. Цель — помочь понять, как возникают вспышки ящура в естественных условиях, чтобы защитить местные стада, а также получить заблаговременную информацию о циркулирующих штаммах вируса.

Первая линия обороны

За последние 15 лет ученые FADRU доказали, что интерфероны — белки, вырабатываемые и высвобождаемые клетками-хозяевами в ответ на присутствие вирусов или других патогенов — защищают от ящура. Интерфероны действуют как противовирусные агенты, убивая вирус или останавливая его размножение.

"Они являются первой линией защиты и ответа на вирусную инфекцию", — говорит микробиолог Тереза де лос Сантос. — "Они защищают животных немедленно, давая вакцине время для вызова иммунного ответа, необходимого для борьбы с болезнью".

Это потенциально очень важный инструмент для контроля вспышек ящура, поскольку ящур распространяется очень быстро; к тому времени, когда животных вакцинируют, вирус может уже распространиться на другие стада.

Существует три семейства интерферонов — тип I (интерферон альфа-бета), тип II (интерферон гамма) и тип III (интерферон лямбда). Бывший химик ARS Марвин Грабман продемонстрировал, что тип I очень эффективен в контроле инфекции вируса ящура у свиней.

"Мы можем привить свиней вирусным вектором, содержащим ген, кодирующий интерферон I типа свиньи, а затем заразить их вирусом ящура через 1 день и защитить их", — говорит Грабман. — "Защита интерфероном I типа может длиться примерно 5 дней, поэтому у нас еще есть пара дней, чтобы покрыть период до того, как иммунитет от вакцины начнет действовать примерно на 7-й день после вакцинации".

Вакцинам требуется 7 дней для выработки защиты от ящура, оставляя вакцинированных животных восприимчивыми к инфекции в это время. Поэтому ученые пытаются закрыть это окно восприимчивости, комбинируя интерфероны с вакцинами.

Комбинируя интерфероны I и II типа, Грабман создал еще одну запатентованную противовирусную технологию доставки вакцины, которая быстро блокирует вирус ящура у свиней. В комбинации с вакциной она обеспечивает полную защиту с 1-го дня до начала иммунного ответа на вакцину. Однако этот подход не был столь успешным у крупного рогатого скота.

Де лос Сантос и вычислительный биолог FADRU Джеймс Чжу нашли решение проблемы быстрой защиты крупного рогатого скота. Команда острова Плам первой сообщила и идентифицировала интерферон III типа у крупного рогатого скота. Они также продемонстрировали, что интерферон III типа эффективен против вируса ящура у крупного рогатого скота уже через 1 день после вакцинации.

Ученые также сконструировали мутантный вирус — "SAP-мутант" — который имеет мутацию в одном из белков вируса, названном "лидер". Они использовали SAP-мутант для разработки аттенуированной (ослабленной) вакцины против ящура, которая при введении свиньям может защитить их от заражения вирулентным вирусом ящура.

Используя подход "обратной генетики", де лос Сантос и ее коллеги выяснили, что SAP-мутантный вирус не способен взаимодействовать с некоторыми белками хозяина, участвующими во врожденном иммунитете. Следовательно, вирус был менее инфекционным и потенциально мог служить основой для эффективного кандидата в живые аттенуированные вакцины против ящура.

Безопасное производство вакцин против ящура

В других исследованиях команда под руководством микробиолога Элизабет Ридер разработала новую технологию производства вакцины против ящура без необходимости использования вирулентного вируса.

"Мы клонировали генетический материал вируса ящура в плазмиде [небольшой молекуле ДНК], что позволяет нам вводить мутации и делеции в вирус и понимать функции определенных частей генома вируса", — говорит Ридер.

Исследователи идентифицировали последовательность, удаление которой делает вирус ящура безвредным для животных, сохраняя при этом его способность расти в культуре клеток. Эта технология безопаснее, чем текущая, использующая природный (дикий) вирус, поскольку аттенуированный вирус ящура не вызывает заболевания у животных. Кроме того, вирус, используемый в вакцине, был помечен уникальными маркерами, чтобы отличать его от дикого вируса, обнаруживаемого при вспышках.

На новую технологию подана заявка на патент, и она разрабатывается для производства вакцин частной компанией.

Идеи из человеческих технологий

Иммунолог Уильям Голде и его команда первыми попробовали на свиньях технологию, используемую врачами для типирования людей при трансплантации органов. Команда использовала ее на свиньях и крупном рогатом скоте для точного измерения иммунных ответов на вакцины против ящура.

Технология, называемая "MHC (главный комплекс гистосовместимости) тетрамерами", позволяет ученым отслеживать иммунные ответы, опосредованные отдельными Т-клетками.

"Человеческая технология очень легко перешла на свиней и крупный рогатый скот", — говорит Голде. — "В сочетании с новыми технологиями отслеживания отдельных B-клеток [клеток, продуцирующих антитела], мы смогли отслеживать иммунные ответы на вакцины и инфекции с большей точностью".

Другая работа Голде включает тестирование автоматизированного безыгольного устройства для доставки вакцины под названием "DermVac", которое индуцирует более сильный иммунитет при меньшей дозе вакцины против ящура. Животные, вакцинированные этим методом с долей рекомендуемой дозы вакцины, были защищены от болезни при заражении ящуром через 7 или 28 дней после вакцинации.

Классический случай вируса свиней

Хотя классическая чума свиней (КЧС) искоренена в США, это контагиозное, иногда смертельное заболевание присутствует в дикой природе в Европе, где зараженные дикие кабаны могут передавать его домашним свиньям.

"Как только болезнь обнаружена, все животные в непосредственной близости от зараженных свиней должны быть уничтожены, что создает огромную экономическую проблему", — говорит микробиолог Мануэль Борка. — "Вакцинация запрещена в Европе, но она будет рассмотрена, если будет разработана маркерная вакцина". Маркерная вакцина позволяет отличать вакцинированных животных от тех, кто заражен диким вирусом.

Ученые на острове Плам под руководством Борки использовали разные стратегии для разработки штаммов вируса для вакцин, отвечающих этим критериям. Они идентифицировали 10–12 различных областей генома вируса, мутация в которых приводит к аттенуации вируса.

Используя этот подход, вирус КЧС был генетически модифицирован не только для его ослабления, но и для введения генетического маркера, позволяющего отличить его от дикого вируса. Борка получил патент на этот маркерный вирус, который обеспечивает ранний иммунитет в первую неделю после вакцинации.

Более ранняя работа по КЧС на острове Плам включала разработку быстрого диагностического теста на основе ПЦР в реальном времени (PCR), который обнаруживает вирус у зараженных животных за 2–4 дня до появления клинических признаков. Тест был дополнительно валидирован с использованием полевых образцов в Доминиканской Республике.

Распространение смертельной болезни свиней

Вспышка африканской чумы свиней (АЧС) в Грузии и соседних странах в 2007 году побудила ARS возобновить усилия по поиску способов предотвращения или контроля этого серьезного заболевания, от которого нет лекарства или вакцины. Беспокойство по поводу АЧС усиливается из-за ее неумолимого распространения в сторону Европы с 2007 года. Ее клинические признаки схожи с признаками КЧС, но АЧС более равномерно смертельна. Свиньи страдают от высокой температуры, кровоизлияний, рвоты и потери аппетита.

"Африканская чума свиней имеет множество штаммов, которые чрезвычайно заразны", — объясняет Борка. — "Все зараженные животные умирают в течение недели".

Все попытки создать эффективные вакцины пока безуспешны из-за сложности и большого размера вируса АЧС.

"У него большой геном, состоящий из более чем 150 генов, что все усложняет", — говорит Борка. — "Исследовать вирус АЧС сложнее, чем более мелкие вирусы, такие как КЧС".

В более ранние годы ученые на острове Плам добились значительного прогресса в понимании роли определенных генов вируса АЧС в возникновении болезни. Борка был частью команды, которой удалось охарактеризовать несколько генов, важных для вирулентности.

"Если удалить некоторые из этих генов, вирус становился несколько ослабленным", — говорит Борка. — "Этот подход использовался в то время для разработки менее вирулентных вирусов, которые можно было бы тестировать в качестве кандидатов на вакцины".

Животные, получившие аттенуированные вирусы, а затем зараженные вирулентным вирусом, были защищены от АЧС.

После 7-летнего перерыва в исследованиях АЧС из-за ограниченного финансирования, исследования были возобновлены учеными ARS под руководством Борки с использованием этих же методов.

"За последние 2 года мы создали рекомбинантные вирусы, используя штамм АЧС, который убивает тысячи животных в регионе Кавказа, путем удаления генов, ранее идентифицированных как важные для аттенуации вируса", — говорит Борка. — "Сейчас мы тестируем эти вирусы на животных, чтобы увидеть, ослаблены ли они и можно ли их использовать в качестве кандидатов на вакцины".

Битва с везикулярным стоматитом

Еще одним захватчиком для скота является вирус везикулярного стоматита (VSV), который редко встречается в США, но может заражать людей и некоторые виды диких животных.

"Он похож на ящур — волдыри на языке, во рту и мясистых частях ног", — говорит Родригес. — "Однако VSV поражает лошадей, а ящур — нет".

Для этого заболевания нет эффективных вакцин, и вирус передается насекомыми. "Черные мухи и москиты, а также крошечные насекомые Culicoides, также называемые 'невидимками'", — говорит Родригес.

Работая с учеными в Мексике, Родригес недавно проследил происхождение большого числа вспышек 2008 года в северной Мексике до южной Мексики. Он идентифицировал штамм вируса и предсказал, что он может распространиться в США. Действительно, этот вирус стал причиной вспышек в Нью-Мексико в 2012 году.

"Мы обнаружили, что вирус, появившийся в США, на самом деле происходит из Мексики, но мы не знаем, как он сюда попадает", — говорит он. — "Мы думаем, что это происходит через насекомых, и обнаружили, что если защитить животных от укусов насекомых, мы можем уменьшить последствия вспышки".