Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА, РИГА)

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), также известная как реакция непрямой гемагглютинации (РИГА), — это высокочувствительный иммунологический метод, используемый для выявления и количественного определения как растворимых антигенов (включая гаптены), так и антител.

Суть метода заключается в том, что эритроциты используются как носители (индикаторы), на поверхность которых предварительно фиксируются либо известные антигены, либо известные антитела. В зависимости от этого различают два основных варианта постановки реакции:

  1. Выявление антител: Эритроциты сенсибилизируют (покрывают) известными антигенами. При добавлении сыворотки, содержащей специфические антитела к этим антигенам, происходит склеивание (агглютинация) эритроцитов.
  2. Выявление антигенов: Эритроциты сенсибилизируют известными антителами. При добавлении исследуемого материала, содержащего соответствующий антиген, происходит агглютинация эритроцитов.

Подготовка эритроцитарных диагностикумов

Для успешного проведения РПГА эритроциты должны прочно удерживать на своей поверхности биологические молекулы. Процесс их подготовки (сенсибилизации) зависит от типа фиксируемого вещества:

  • Полисахаридные антигены и гаптены обычно хорошо адсорбируются на поверхности нативных (необработанных) эритроцитов.
  • Белковые антигены и антитела требуют предварительной обработки поверхности эритроцитов для улучшения адсорбции. Чаще всего для этого используют:
    • Трипсин (ферментативная обработка).
    • Танин (химическая обработка).
  • Для прочного (ковалентного) присоединения некоторых антигенов (например, кислых полисахаридов) к поверхности эритроцитов применяют глутаровый альдегид.

Для увеличения срока хранения и стабильности готовых препаратов (эритроцитарных диагностикумов) эритроциты часто подвергают дополнительной специальной обработке (например, формалинизации).

Техника постановки реакции

Реакцию обычно проводят в лунках пластиковых (плексигласовых) панелей.

Титрование антител

  1. Инактивированную и адсорбированную исследуемую сыворотку пациента последовательно разводят (чаще всего двукратными разведениями) в лунках панели.
  2. В каждую лунку с разведением добавляют стандартный объем (например, 0,25 мл) эритроцитарного диагностикума, сенсибилизированного известным антигеном.
  3. Обязательно ставят контроли:
    • Диагностикум с нормальной (неиммунной) сывороткой.
    • Исследуемая сыворотка с несенсибилизированными эритроцитами.
  4. Панель инкубируют в термостате (обычно 2 часа при 37 °C).
  5. Учёт результата проводят визуально по характеру осадка эритроцитов на дне лунки (аналогично реакции активной гемагглютинации). Положительный результат — агглютинация (образование «зонтика» или плёнки), отрицательный — компактный осадок в виде «пуговки».

Титрование антигенов

Методика аналогична, но в качестве индикатора используют эритроцитарный диагностикум, сенсибилизированный известными антителами. Его добавляют к серии разведений исследуемого материала, предположительно содержащего антиген.

Практическое применение

При отсутствии коммерческих диагностикумов их можно изготовить в лабораторных условиях. В качестве основы чаще всего используют эритроциты человека с группой крови 0(I), которые не содержат естественных групповых антигенов A и B, что позволяет избежать неспецифических реакций.

РПГА широко применяется в серологической диагностике инфекционных заболеваний (брюшной тиф, туляремия, чума, сифилис — РПГА с трепонемным антигеном), для определения концентрации гормонов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ в сыворотке крови.