К поверхности клетки и дальше: отслеживание транспорта гликопротеинов в субклеточных компартментах с помощью модифицированного холерного токсина
Белки в эукариотических клетках часто модифицируются в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и аппарате Гольджи. Одна из таких модификаций — гликозилирование, присоединение сахаров (гликанов) к новосинтезированным белкам. Гликаны обеспечивают правильное сворачивание, стабильность и биологическую активность белков. Однако точные механизмы гликозилирования в ЭР и Гольджи до конца не изучены, чему мешает отсутствие методов направленной доставки молекул в эти органеллы.
Группа учёных из Японии исследовала возможность модификации холерного токсина (CT) для целевой доставки в ЭР и Гольджи. CT состоит из двух субъединиц: CTA (вызывает диарею) и CTB (обеспечивает проникновение в клетку). Естественный путь токсина: попадание в клетку → эндосомы → аппарат Гольджи → ЭР (благодаря специфической аминокислотной последовательности в CTA). «CT естественным образом доставляется именно в Гольджи и ЭР, что сделало его привлекательным кандидатом для нашего исследования», — поясняет доктор Аяно Сато.
Исследователи химически синтезировали искусственную гликозилированную форму нетоксичной субъединицы CTB. Для отслеживания её внутриклеточного пути использовали систему биолюминесценции HiBiT на основе фермента люциферазы. Больший фрагмент люциферазы присоединяли к рецепторам на ЭР и Гольджи, а CTB метили меньшим фрагментом. Свечение возникало при связывании фрагментов, что позволило в реальном времени отслеживать перемещение CTB.
«Мы разработали и синтезировали гликозил-CTB и показали его транспорт в ЭР и Гольджи живых клеток. Мы также установили метод количественного мониторинга этого транспорта», — говорит доктор Сато.
Успешный метод доставки и мониторинга открывает новые возможности для изучения модификаций белков в живых клетках. Метод позволяет создавать различные мутантные формы CTB, несущие разные гликаны, для исследования функций N-гликанов.
Кроме того, CTB-опосредованная доставка может стать инструментом для целевой доставки лекарств в конкретные органеллы. «Наша система может помочь в лечении болезней, вызванных отсутствием ферментов в специфических органеллах», — отмечает доктор Сато.
«Современные методы доставки лекарств ограничены таргетированием только поверхности клетки. Наша система может расширить эти пределы и обеспечить доставку препарата именно туда, где это необходимо», — заключает исследователь.