Туберкулёзный патоген высвобождает свой токсин через новую систему белкового транспорта
Шесть лет назад Майкл Нидервайс, Ph.D., описал первый обнаруженный токсин смертельного патогена Mycobacterium tuberculosis. Этот токсин, туберкулёзный некротизирующий токсин (tuberculosis necrotizing toxin, TNT), стал первым представителем нового класса ранее нераспознанных токсинов, присутствующих более чем у 600 видов бактерий и грибов, что было определено по сходству белковых последовательностей. Токсин высвобождается, когда бактерии M. tuberculosis выживают и растут внутри клетки-хозяина — макрофага человека, убивая макрофаг и позволяя бактериям вырваться и распространиться.
В течение 132 лет отсутствие идентифицированного токсина у M. tuberculosis контрастировало с почти всеми другими патогенными бактериями, чьи токсины способствуют заболеванию или смерти. M. tuberculosis ежегодно заражает 9 миллионов человек и убивает более 1 миллиона.
Теперь в другой новаторской работе исследователь из Университета Алабамы в Бирмингеме и его коллеги описывают, как два небольших белка ESX, продуцируемые бактериями M. tuberculosis, опосредуют секрецию TNT путём образования пор в мембранах, окружающих бактерии. Это открытие может иметь широкое применение, поскольку отличительный мотив из трёх аминокислот, обнаруженный на EsxE и EsxF — триптофан/любая аминокислота/глицин (WXG) — также присутствует на многих других небольших белках микобактерий и в большом суперсемействе бактериальных белков WXG100, которые напоминают EsxE и EsxF.
"Здесь мы впервые показываем, что небольшие белки Esx семейства WXG100 имеют важную молекулярную функцию внутри клетки M. tuberculosis, опосредуя секрецию токсина", — сказал Нидервайс. "Наши результаты предполагают динамический механизм образования пор малыми белками Esx, который может быть применим к другим членам большого семейства белков WXG100".
TNT — это один из двух доменов в белке внешней мембраны M. tuberculosis CpnT; активность домена TNT в цитозоле макрофага индуцирует гибель макрофага путём гидролиза NAD+. У M. tuberculosis есть внутренняя и внешняя мембрана, и белку необходимо пройти через каждый слой, чтобы быть секретированным за пределы бактерии. Как CpnT попадает во внешнюю мембрану, было неизвестно.
EsxE и EsxF являются частью того же генного сегмента, что и CpnT, и исследователи предположили, что эти два небольших белка могут быть вовлечены в секрецию токсина.
Создав различные штаммы, лишённые либо EsxE, либо EsxF, они показали, что оба белка необходимы для транслокации CpnT на поверхность клетки M. tuberculosis и для секреции TNT в цитозоль макрофагов, инфицированных M. tuberculosis. Более того, EsxE и EsxF являются доступными на поверхности белками M. tuberculosis в виде мембрано-ассоциированного комплекса.
Чтобы узнать больше о механизме этой транслокации, команда создала мутанты каждого белка Esx, где аминокислота триптофан единственного мотива WXG на каждом белке была заменена на аланин. Мутанты показали, что интактный мотив WXG на EsxE и EsxF необходим для эффективной транслокации CpnT во внешнюю мембрану M. tuberculosis и последующей секреции TNT в цитозоль инфицированных макрофагов.
Очистка водорастворимых белков EsxE и EsxF показала, что они образуют димеры EsxE-EsxF, и пять таких димеров собирались в звездообразные структуры, что было видно под электронным микроскопом. Каждая структура была около 10 нанометров в поперечнике с центральной порой в 3 нанометра.
Эксперименты с планарными липидными бислоями были ключевыми для понимания молекулярной функции EsxE-EsxF, так как они показали, что поры EsxE-EsxF формируют каналы через липидные мембраны.
Наконец, исследователи показали, что мотивы WXG необходимы для образования пор и разрушения мембраны комплексом EsxE-EsxF, и эти мотивы опосредовали сборку функциональных олигомеров EsxE-EsxF. Это теперь определяет биохимическую роль для ранее загадочного мотива WXG.
"EsxE и EsxF представляют собой первые известные компоненты внешней мембраны, опосредующие секрецию белка у M. tuberculosis", — сказал Нидервайс. "Однако маловероятно, что EsxE и EsxF достаточны для секреции TNT, поскольку во всех известных бактериальных системах секреции белков требуется источник энергии. Поэтому возможно, что EsxE-EsxF ассоциируют с другими белками или белковыми комплексами для осуществления экспорта CpnT и секреции TNT".
Исследователи предлагают две модели транспорта CpnT с помощью EsxE и EsxF. В первой гетеродимеры EsxE-EsxF образуют пору во внутренней мембране, а затем формируют другую пору во внешней мембране, создавая трансмембранные каналы. "В качестве альтернативы, — сказал Нидервайс, — канал внутренней мембраны удлиняется, чтобы охватить периплазму посредством образования филаментов, и соединяется с порами EsxE-EsxF во внешней мембране, экспонируя EsxF на поверхности клетки. В этой модели предполагаемый туннельный канал EsxE-EsxF обеспечивает экспорт полипептида CpnT во внешнюю мембрану M. tuberculosis и последующую секрецию TNT и EsxE-EsxF".
Соавторами Нидервайса в исследовании "Pore-forming Esx proteins mediate toxin secretion by Mycobacterium tuberculosis", опубликованном в Nature Communications, являются Удей Так и Терье Докланд, UAB Department of Microbiology.