Метод секвенирования, достаточно точный для изучения механизмов устойчивости бактерий к антибиотикам

Новая технология, Maximum Depth Sequencing (MDS), позволяет определять последовательность «букв» ДНК с такой точностью, что можно отследить, как бактерии используют высокоскоростную эволюцию для преодоления действия антибиотиков. К такому выводу пришло исследование под руководством учёных из NYU Langone Medical Center, опубликованное 22 июня в журнале Nature.

MDS устраняет ошибки, вносимые ключевыми методами в основе современных высокопроизводительных секвенаторов, и позволяет улавливать настолько редкие генетические изменения, которые старые методы не могли отличить от ошибки машины.

«Мы впервые смогли напрямую измерить как стандартную скорость изменения последовательностей ДНК в генетическом коде бактерии, так и "горячие точки", где микробы включают генетические изменения во много раз быстрее среднего, чтобы сделать антибиотики бесполезными», — говорит старший автор работы Евгений Нудлер.

Исключительно глубокое секвенирование

Современные высокопроизводительные секвенаторы определяют порядок трёх миллиардов оснований в геноме человека примерно за десять часов. Проблема стандартных методов в том, что любые ошибки, допущенные на этапе первоначального копирования фрагмента ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы, тиражируются во всех последующих копиях, что не позволяет отличить их от редких естественных мутаций.

Первая инновация, описанная в работе, — использование полимеразы для создания штрих-кодов на концах оригинальных фрагментов ДНК, а не для создания подверженной ошибкам копии самого фрагмента. Затем метод создаёт множество независимых копий этих фрагментов с баркодами. Таким образом, ошибки, вносимые полимеразой или процессом секвенирования, проявляются лишь в некоторых версиях последовательности, но не во всех в одном и том же месте, что позволяет их отбросить.

Новый метод фокусируется на более коротких участках ДНК («регионах интереса»), что позволяет секвенировать каждый оригинальный фрагмент многократно за один запуск.

Результаты исследования

Используя новую технологию, авторы с достаточной статистической достоверностью наблюдали мутации и впервые точно рассчитали стандартную, постоянную скорость мутаций у бактерии E. coli. Знание базовой скорости мутаций также позволило выявить мутации, происходящие в десять раз чаще среднего в определённых частях генома E. coli под воздействием антибиотиков.

Команда обнаружила, что дозы ампициллина и норфлоксацина, недостаточные для немедленной гибели бактерий, вызывая окислительный стресс и повреждение ДНК в бактериальных клетках, подавляли систему репарации неспаренных оснований (mismatch repair). Это позволяло бактериям быстрее изменять свой генетический код с целью эволюционировать в обход лечения.

«Мы никогда бы не увидели эти процессы, но теперь можем надеяться использовать эти знания, чтобы лишить бактерии фундаментального механизма приобретения устойчивости», — говорит Нудлер.

Помимо обнаружения редких мутаций в бактериальной ДНК, MDS обещает быть полезной для выявления редких мутантов в популяциях человеческих клеток. Теоретически, метод может идентифицировать редкие «предраковые» генетические мутации в клетках задолго до образования опухоли с помощью анализа крови. Соответствующие исследования уже ведутся.