Учёные борются с систематической ошибкой в секвенировании ДНК нового поколения
Секвенирование ДНК, особенно при изучении универсального для бактерий гена 16S рРНК, остаётся подверженным ошибкам. Исследователи из Консорциума по изучению вагинального микробиома Университета Содружества Виргинии (VCU) решили открыто изучить эту проблему.
Суть проблемы
Процесс анализа ДНК включает несколько этапов: экстракцию ДНК из образца, её амплификацию (копирование) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирование и классификацию. Каждый из этих этапов по-разному влияет на различные бактерии, что приводит к систематической ошибке (bias). Например, ДНК одних бактерий извлекается легче, чем других, а при амплификации можно пропустить редкие штаммы.
Экспериментальный и статистический подход
Учёные создавали смеси образцов с известными пропорциями семи штаммов бактерий, критически важных для вагинального микробиома. Эти смеси («истина») пропускали через стандартный процесс секвенирования, а затем сравнивали полученные результаты с исходными данными.
На основе этих экспериментов были построены статистические модели двух типов:
- Прямые модели: предсказывают, какие пропорции бактерий будут наблюдаться после обработки.
- Обратные (inverse) модели: пытаются по наблюдаемым данным восстановить исходный состав сообщества бактерий.
Методология заимствована из экспериментов со смесями, используемых в химической и пищевой промышленности (например, для подбора рецептуры бензина или теста для печенья).
Результаты
Ошибки оказались значительными. В одном случае смесь, состоявшая из 50% одной бактерии и 50% другой, после анализа показала соотношение, близкое к 85% и 15%. Это происходит, даже если использовать различные наборы для экстракции ДНК, чтобы компенсировать ошибку.
Цель и перспективы
Исследователи подчёркивают, что наблюдаемый в образце состав бактерий не всегда точно отражает реальную ситуацию в среде. Их цель — разработать универсальную систему контроля качества для воспроизводимых исследований. Модели, созданные для семи конкретных бактерий, планируется расширить для применения к любой среде и любым бактериям.
Работа «The Truth about Metagenomics: Quantifying and Counteracting Bias in 16S rRNA Studies» опубликована в журнале BMC Microbiology.