SSRgenotyper: новый инструмент для цифрового генотипирования простых тандемных повторов

SSRgenotyper — это новый бесплатный биоинформатический инструмент, позволяющий исследователям проводить цифровое генотипирование секвенированных популяций с использованием простых тандемных повторов (SSR). Ранее эта задача требовала трудоёмких лабораторных методов.

Как сообщается в недавнем выпуске журнала Applications in Plant Sciences, разработчики создали программу для бесшовной интеграции с другими приложениями, используемыми для обнаружения и анализа SSR.

Простые тандемные повторы — это короткие цепочки повторяющихся нуклеотидов, склонные к мутациям. Их вариабельность делает SSR идеальными маркерами для генетического анализа, позволяющего различать особи. Они часто являются маркером выбора для отцовского и судебно-медицинского тестирования.

В исследовательских областях SSR имеют дополнительное преимущество — они селективно нейтральны. Это означает, что они не кодируют физические признаки и, следовательно, не подвержены большинству типов естественного отбора, что делает их отличным инструментом для изучения популяций без искажающего эффекта конвергентной эволюции.

Недавние достижения в секвенировании нового поколения (NGS) помогли упростить процесс идентификации SSR, особенно у модельных организмов или групп с доступной референсной сборкой генома. По мере совершенствования технологий и снижения стоимости секвенирования, секвенирование больших частей генома для целей SSR-анализа становится более осуществимым и распространённым в научной литературе, даже для немодельных организмов.

Однако процесс генотипирования — определения того, какие аллели есть у каких особей — по-прежнему в основном основан на визуализации амплифицированной ДНК в геле для электрофореза. Это сложный и потенциально опасный процесс, так как фрагменты ДНК часто окрашивают канцерогенными химическими веществами.

Кроме того, существует проблема измерения аллелей на основе размера полученных полос, что является лишь оценкой количества нуклеотидов в амплифицированном фрагменте ДНК. Поскольку во фланкирующих областях, окружающих SSR, могут быть небольшие вариации, и поскольку не существует стандартизированного метода определения размера аллеля с помощью этих методов, результаты генотипирования одного эксперимента нельзя легко перенести или сравнить с результатами другого.

Разработка SSRgenotyper делает такие лабораторные методы устаревшими. Работая в тандеме с другими биоинформатическими программами, которые обнаруживают SSR в референсной ДНК, и программами, которые выравнивают данные секвенирования из целевых популяций с соответствующим SSR-референсным файлом, SSRgenotyper способен быстро генотипировать все SSR для каждого индивидуально секвенированного образца.

«SSRgenotyper делает следующий шаг, генотипируя SSR в секвенированных популяциях — строго на основе данных секвенирования (без ПЦР или электрофореза), — сказал Джефф Моган, профессор наук о растениях и дикой природе в Университете Бригама Янга и старший автор исследования. — Результатом работы SSRgenotyper являются файлы, готовые для популяционно-генетического анализа или построения карт сцепления».

Программа не только сокращает время и трудозатраты, необходимые для генотипирования популяций, но и решает проблему переносимости, присущую оценкам на основе электрофореза, путём прямого подсчёта общего количества пар оснований в данном тандемном повторе.

«Поскольку SSR генотипируются на основе количества повторяющихся мотивов в локусе SSR, а не на основе размера продукта ПЦР, вызовы аллелей стандартизированы и переносимы от проекта к проекту или из лаборатории в лабораторию», — сказал Моган.

Программа, написанная на Python 3, требует для запуска только трёх позиционных аргументов, предоставляет возможность указать несколько условных аргументов (например, пороговые значения процента гетерозиготности, размер фланкирующих областей и для удаления ложных аллелей) и может выполняться на обычном настольном компьютере.

После завершения работы SSRgenotyper генерирует несколько типов файлов, включая базовые сводные и статистические файлы, а также файлы .pop, .map и файл выравнивания, отформатированный для использования в других программах для облегчения последующего анализа.

В качестве доказательства концепции Моган и его коллеги проверили точность SSRgenotyper в правильном определении генотипа особи, запустив программу на общедоступных последовательностях киноа (Chenopodium quinoa) и вида овса Avena atlantica. Полученная точность составила 97% или выше и увеличивалась при включении дополнительных ридов секвенирования.

С постоянным развитием и повышением эффективности методов секвенирования нового поколения такие инструменты, как SSRgenotyper, по-видимому, готовы сократить объём лабораторной работы, необходимой в генетических исследованиях.

«Секвенирование уже является методом выбора в большинстве генетических исследовательских проектов, — сказал Моган. — Поскольку затраты продолжают снижаться, а новые биоинформатические инструменты разрабатываются, весьма вероятно, что будущие популяционно-генетические исследования будут основываться исключительно на секвенировании нового поколения — полностью избегая громоздких задач ПЦР и электрофореза».