Новая чувствительная и надежная методика секвенирования РНК одиночных клеток превосходит аналоги

Метод секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq) произвел революцию в медицине и биологии, однако существующие подходы ограничены потенциальными неточностями в определении клеточного состава и неэффективной амплификацией комплементарной ДНК (кДНК) в ходе широко используемой реакции переключения матрицы.

Исследовательская группа из Японии под руководством доцента Шигеюки Шичино и профессора Коуджи Матсушкимы из Токийского университета науки разработала усовершенствованную методику scRNA-seq — terminator-assisted solid-phase cDNA amplification and sequencing (TAS-Seq). Этот метод использует простые материалы и оборудование для получения данных scRNA-seq с более высокой точностью, чем у широко применяемых в настоящее время технологий.

Суть метода TAS-Seq:

• Для амплификации кДНК используется независимый от матрицы фермент терминальная трансфераза (TdT), который сложен в работе.
• Чтобы решить эту проблему, в реакцию амплификации кДНК добавляется дидезоксинуклеотидфосфат (ddNTP), выступающий в роли "терминатора".
• ddNTP, в частности дидезоксицитидинфосфат (ddCTP), останавливает чрезмерное удлинение поли-N-хвоста ферментом TdT стохастическим образом, что значительно снижает технические сложности реакции.
• Метод также использует платформу scRNA-seq на основе нанолунок/шариков, что позволяет изолировать одиночные клетки в образцах тканей, уменьшая систематическую ошибку отбора клеток и повышая точность данных об их составе.

Сравнение с существующими методами:

В ходе проверки на образцах тканей легких мыши и человека эффективность TAS-Seq сравнили с широко используемыми методами 10X Chromium V2 и Smart-seq2. Было обнаружено, что TAS-Seq:

• Определяет больше генов в целом.
• Выявляет больше генов с высокой вариабельностью экспрессии.
• Превосходит аналоги по чувствительности детекции генов и частоте "потери" генов (gene drop-out rates).
• Более равномерно детектирует гены в широком диапазоне уровней экспрессии, включая гены факторов роста и интерлейкинов.
• Менее подвержен батч-эффектам (систематическим ошибкам между экспериментами).
• Данные TAS-Seq сильно коррелируют с данными проточной цитометрии, что указывает на высокую точность определения клеточного состава.

Перспективы:

Разработчики уже создали улучшенную версию — TAS-Seq2, которая демонстрирует в 1.5–2 раза более высокую чувствительность детекции генов в клетках селезенки мыши. Для предоставления услуг scRNA-seq с использованием TAS-Seq и TAS-Seq2 было основано венчурное предприятие ImmunoGenetics.

Новые методы будут способствовать открытию новых терапевтических мишеней, развитию области пространственной транскриптомики и ускорят развитие технологий омики одиночных клеток, углубляя понимание принципов биологии и развития заболеваний.