Улучшение точности длинноридового секвенирования генома

Международная команда исследователей из США, Германии и Китая разработала способ повысить точность длинноридового секвенирования генома. В статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology, группа описывает, как они усовершенствовали существующую методику и насколько хорошо она работает.

Исследователи отметили, что текущие технологии секвенирования ДНК позволяют либо точно секвенировать короткие последовательности (короткие риды), либо менее точно — длинные последовательности (длинные риды). В этой работе они стремились повысить точность именно длинноридового секвенирования, а точнее — улучшить технику циклического консенсусного секвенирования (circular consensus sequencing, CCS) с использованием одно-молекулярного секвенирования в реальном времени (single-molecule, real-time, SMRT) от компании Pacific Bioscience (PacBio). Большинство участников проекта были из PacBio; остальные — из Google, Стэнфордского университета, Института Макса Планка, Саарландского университета, DNAnexius, NIST, Национального института исследования генома человека, Китайской академии сельскохозяйственных наук, Онкологического института Дана-Фарбер и Университета Джонса Хопкинса.

Используемая PacBio техника CCS (которая не считается длинноридовой) включает лигирование шпилечных адаптеров к концам молекул ДНК для создания шаблона. Полимераза начинает с адаптера и проходит по фрагменту ДНК, добавляя основания и создавая рид. Техника также предполагает многократное прохождение полимеразы по одному фрагменту ДНК. Обычно CCS использовалась для длин оснований от 1000 до 2000. Улучшив методику, команда смогла точно считывать до 10 000 оснований.

Улучшения в основном были основаны на повышении качества ДНК, используемой в начале секвенирования. Качество ДНК повысили, запуская реакции до загрузки ДНК и ожидая до часа — если полимераза продолжала двигаться, это указывало на более высокое качество. Также учёные обеспечили единообразный размер всех молекул ДНК с помощью прибора SageELF.

Усовершенствованная методика генерирует длинные риды (в среднем 13.5 килобаз) с точностью 99.9%.