In situ sequencing of полностью структурированного генома

Хотя информацию, закодированную в последовательности гена, можно представить двумя битами на пару оснований, это далеко не полное описание. Реальный организм не может самоорганизоваться в процессе развития при такой скорости передачи данных.

На это есть много причин:

• Набор символов для пар оснований — не четыре, а десятки символов из-за эпигенетических модификаций, таких как метилирование и ацетилирование.
• Характер самого хроматинового каркаса активно меняется в течение жизненного цикла клетки и организма.
• Эпигенетические метки — это не просто теги "вкл/выкл", а структурированные процессы, разворачивающиеся во времени.

Ключевой фактор — пространственная конфигурация ДНК и РНК. Исследователи из Broad Institute представили в журнале Science новый метод, который захватывает не только сырую последовательность, но и её пространственное положение в конкретный момент времени.

Пока никто не секвенирует целые геномы таким способом. Однако, секвенируя и локализуя достаточно небольших участков хромосомы, можно точно определить её расположение в ядре. Теперь к битам (A, C, G, T) добавляются биты (X, Y, Z). Это важно, поскольку в разных частях ядра (у мембраны, ядрышка, других хромосом) происходят разные процессы. Пространственная конфигурация определяет, какие участки доступны для транскрипции или репликации, и сама может считаться формой эпигенетической информации.

Как это работает

Вместо извлечения ДНК для секвенирования, исследователи создали секвенирующие библиотеки внутри фиксированных ядер клеток — человеческих фибробластов или мышиных эмбрионов на стадии двух и четырех клеток. Затем они использовали in situ sequencing для считывания библиотек с помощью флуоресцентной микроскопии. Каждое пятно — это амплифицированный фрагмент ДНК, где цвета указывают на четыре основания.

После секвенирования Illumina интеграция по уникальным штрих-кодам дает примерно 1000 пространственно разрешенных ридов на ядро. Каждое такое местоположение включает данные последовательности длиной в несколько сотен пар оснований. Этого достаточно, чтобы вычислительно соединить точки и построить карты всего ядра, показывающие, как свернут геном в данный момент времени. Исследователи также использовали информацию о генотипе для сравнения организации материнских и отцовских хромосом на разных стадиях развития.

На вопрос, можно ли использовать их методы для секвенирования и визуализации митохондриальной ДНК (что интересно для изучения гетероплазмии в нейронах), автор-корреспондент Джейсон Бьенростро ответил, что они ещё не оптимизировали параметры для этого, но это должно быть возможно. При этом нужно учитывать, как работать с NUMTs (ядерными последовательностями митохондриального происхождения), если митохондрии пространственно перекрываются с областями около ядра.

Новое исследование также показало, что из-за уникальных мега-NUMT вариантов отцовское наследование гетероплазмичной мтДНК может быть ещё более редким, чем предполагалось ранее. Поскольку родительские геномы сохраняют значительные различия в ядрах на ранних стадиях развития, in situ sequencing может быть полезен для выяснения, как долго сохраняется это явление.

Джейсон ожидает, что теперь, с заложенным фундаментом, следует ожидать устойчивого развития подходов с более высоким разрешением.