Метаболическая инженерия E. coli для секреторного производства свободного гема

Исследователи из KAIST разработали новую стратегию секреторного производства свободного гема с использованием модифицированных штаммов Escherichia coli (E. coli). Они использовали C5-путь, оптимизированные последующие пути и экспортер гема для создания рекомбинантного микроорганизма, производящего внеклеточный гем в процессе ферментации с подпиткой. Это первое сообщение о внеклеточном производстве гема с помощью инженерных штаммов E. coli.

Данная стратегия ускорит эффективное производство свободного гема, который может служить биодоступным источником железа и важной простетической группой для множества гемопротеинов в медицинских целях. Исследование под руководством профессора Санг Юпа Ли из Департамента химической и биомолекулярной инженерии KAIST было опубликовано в Nature Catalysis 28 августа.

Гем — металлоорганическое соединение, комплексованное с ионом Fe²⁺, — это важная молекула, переносящая кислород в крови многих животных. Он также является ключевым компонентом цепей переноса электронов, ответственных за дыхание аэробных организмов, включая разнообразные бактерии. Сейчас он широко применяется как биодоступный источник железа в сфере здравоохранения и индустрии пищевых добавок. Спрос на гем и потребность в его эффективном производстве продолжают расти.

Многие предыдущие исследователи пытались производить свободный гем с помощью модифицированных E. coli. Однако ни в одном из исследований не удалось получить свободный гем внеклеточно, что требовало дополнительного этапа экстракции накопленного в клетках гема для последующего использования. Секреция гема в форме гем-пептидов или белков также требует этапа выделения свободного гема из секретируемых продуктов. Таким образом, секреторное производство свободного гема — важная задача для экономичного получения гема, пригодного для потребления человеком.

Хотя некоторым исследователям удавалось производить внутриклеточный гем с использованием рекомбинантных штаммов E. coli, его конечный титр был крайне низким из-за применения неоптимальных метаболических путей. Кроме того, добавление предшественников L-глицина и сукцината считалось нежелательным для крупномасштабного промышленного производства. Следовательно, необходимо было сконструировать оптимизированный путь биосинтеза гема для обеспечения его эффективного производства и изучить последующую секрецию свободного гема.

Чтобы решить эту проблему, команда KAIST использовала несколько стратегий для производства внеклеточного свободного гема за счет усиления его биосинтеза в E. coli.

1. Сначала были исследованы возможности C4- и C5-путей для производства аминолевулината (ALA) без добавления предшественников.
2. После подтверждения превосходства C5-пути над C4-путем, были сверхэкспрессированы метаболические гены C5-пути и последующих путей биосинтеза гема.
3. Затем метаболические пути были оптимизированы путем регулирования уровней экспрессии соответствующих генов и инактивации предполагаемого фермента деградации гема, кодируемого геном yfeX.

В результате полученный штамм секретировал значительное количество гема в среду. Последующая оптимизация условий культивирования и добавление источников азота дополнительно увеличили как титр общего свободного гема, так и количество свободного гема, секретируемого в среду. Наконец, сверхэкспрессия генов ccmABC, кодирующих экспортер гема, еще больше усилила производство и секрецию гема, позволив получить рекордный титр гема как внутри-, так и внеклеточно из глюкозы.

Профессор Ли заявил: «Экологически чистая и устойчивая химическая промышленность — ключевая глобальная задача, стоящая перед каждой нацией. Мы проводим исследования для биосинтеза природных соединений с высокой концентрацией, выходом и производительностью. Эта новая технология послужит возможностью для продвижения биохимической промышленности вперед».