Найдена самая маленькая рабочая система CRISPR
Древняя группа микробов, содержащая одни из самых маленьких форм жизни на Земле, также обладает самой маленькой из известных систем геномного редактирования CRISPR.
Крошечный белковый комплекс, названный Cas14, родственен белку Cas9 — ключевому компоненту революционного инструмента редактирования генов CRISPR-Cas9, — но составляет лишь треть его размера. В то время как Cas9 был выделен из бактерий, Cas14 обнаружен в геноме группы архей — примитивных родственников бактерий, — которая включает одни из самых маленьких известных клеток и геномов.
Белки Cas9 и другие Cas-белки являются частью защитной системы, развитой микробами для защиты от вирусов. Все они представляют собой направленные ферменты, которые избирательно находят и связываются с определённой последовательностью ДНК или РНК (у микробов — с последовательностями, хранящимися в их «банках памяти» CRISPR после предыдущих вирусных инфекций), а затем разрезают эту ДНК или РНК, чтобы обезвредить нового захватчика.
Как и Cas9, Cas14 имеет потенциал в качестве биотехнологического инструмента. Благодаря своему малому размеру, он может быть полезен для редактирования генов в маленьких клетках или некоторых вирусах. Однако, обладая активностью по разрезанию одноцепочечной ДНК, он с большей вероятностью найдёт применение в быстрых диагностических системах на основе CRISPR, разрабатываемых для инфекционных заболеваний, генетических мутаций и рака.
«Для молекулярной диагностики нужно уметь нацеливаться на двуцепочечную ДНК, одноцепочечную ДНК и РНК, — сказал Лукас Харрингтон, аспирант UC Berkeley и первый автор статьи. — Cas12 отлично распознаёт двуцепочечную ДНК, Cas13 — одноцепочечную РНК, а теперь Cas14 завершает набор: он отлично распознаёт одноцепочечную ДНК».
Cas14 похож на Cas12 и Cas13 тем, что после связывания с целевой последовательностью ДНК он начинает неразборчиво разрезать всю одноцепочечную ДНК внутри клетки. В отличие от него, Cas9 связывается и разрезает только целевую ДНК.
Беспорядочное разрезание ДНК может быть недостатком для терапии, но большим преимуществом для диагностики. Белок Cas14 можно объединить с флуоресцентным маркером, прикреплённым к фрагменту одноцепочечной ДНК. Когда Cas14 связывается со своей целевой последовательностью ДНК (например, геном рака или геном инфекционной бактерии) и начинает разрезать ДНК, он также разрежет ДНК, связанную с маркером, что вызовет флуоресцентный сигнал.
«Cas14 нацеливается на одноцепочечную ДНК гораздо более специфично, чем Cas12, — добавила коллега Харрингтона, Дженис Чен, недавно получившая степень Ph.D. в UC Berkeley. — Это было действительно неожиданное открытие. Из-за его крошечного размера мы едва ли думали, что он сможет работать, но на самом деле он сверхспецифичен, что также делает его очень мощным дополнением к диагностическому инструментарию».
Харрингтон, Чен и их коллеги, включая изобретателя CRISPR-Cas9 Дженнифер Даудну, адаптировали Cas14 для работы со своей диагностической системой DETECTR, которая сейчас использует Cas12 и Cas13 для быстрого обнаружения инфекционных организмов и генетических мутаций.
Открытие будет опубликовано онлайн 18 октября в журнале Science.
Поиск в метагеномах
Белок Cas14 был обнаружен соавторами Харрингтоном и Дэвидом Бурштейном при поиске вариантов Cas в базе данных микробных геномов, созданной за последние 15 лет их коллегами из UC Berkeley. Геномы, насчитывающие десятки тысяч образцов, были получены с помощью метагеномного секвенирования всей ДНК из проб, взятых в различных экзотических средах. Cas14 был найден в геноме архей, секвенированных из проб грунтовых вод с места очистки от токсичных отходов в Рифле, Колорадо.
Два года назад Харрингтон и Бурштейн обнаружили другие маленькие Cas-белки, CasX и CasY, также анализируя метагеномную базу данных.
Cas14 вдвое меньше — его длина составляет от 400 до 700 аминокислот — чем CasX, и меньше всех других известных Cas-систем, длина которых варьируется от 950 до 1400 аминокислот.
«По случайности мы нашли эти очень маленькие белки, которые другие люди просто отбрасывают, потому что они не похожи на ранее известные системы CRISPR. Они слишком малы, — сказал Харрингтон. — Мы решили: а чёрт с ним, давайте попробуем. Мы протестировали их и были действительно шокированы, обнаружив, что это функциональные системы».
Обнаружение гена Cas14 в базе данных было только началом. Большинство Cas-белков на сегодняшний день найдены в бактериях и хорошо работают в стандартной лабораторной бактерии E. coli. Но Cas14 происходит из архей — и из группы самых маленьких архей, называемых DPANN. Все Cas-белки используют фрагменты РНК для нацеливания и связывания, но Cas14 не работает с РНК CRISPR-Cas9, поэтому команде также пришлось извлечь из базы данных две РНК, необходимые для функционирования Cas14.
Кроме того, археи DPANN нельзя выращивать в лаборатории — они, по-видимому, паразитируют или каким-то образом зависят от других, более крупных архей, — поэтому исследователям пришлось создать подходящую среду в пробирке.
Соответствуя своему происхождению от более примитивного микроба, уменьшенный Cas14, по-видимому, является более примитивной версией более крупных и сложных белков Cas9 и Cas12, что намекает на их эволюцию на протяжении эонов в сторону большей специализации.
Харрингтон отметил, что метагеномный поиск выявил различные версии Cas14, которые могут оказаться полезными биотехнологическими инструментами. «Одна удивительная вещь ... — это то, насколько разнообразны эти системы, — сказал он. — Мы описали более 40 новых систем CRISPR-Cas14 и восемь различных подтипов. Это открывает шлюзы для исследования этих новых систем CRISPR».