CRISPR-ферменты в стиле Pac-Man перспективны для диагностики заболеваний
Исследователи из Калифорнийского университета в Беркли описали 10 новых CRISPR-ферментов, которые после активации ведут себя как Pac-Man, расщепляя РНК. Это свойство можно использовать для создания чувствительных детекторов инфекционных вирусов.
Новые ферменты являются вариантами белка CRISPR-Cas13a. В сентябре 2022 года в журнале Nature та же группа показала, что Cas13a можно использовать для детекции специфических последовательностей РНК, например, вирусных. После связывания с целевой РНК Cas13a начинает неспецифически разрезать всю окружающую РНК, включая репортерные молекулы, что приводит к флуоресценции и позволяет зафиксировать сигнал.
Две команды из Broad Institute позже объединили CRISPR-Cas13a с амплификацией РНК. Эта система, названная SHERLOCK, смогла детектировать вирусную РНК (например, денге и Зика) в крайне низких концентрациях. Подобная система может обнаруживать любой тип РНК, включая характерную для раковых клеток.
Исходный фермент Cas13a, использованный обеими группами, разрезает РНК по одному конкретному нуклеотиду — урацилу. Три из новых вариантов Cas13a разрезают РНК по аденину. Это различие позволяет проводить одновременную детекцию двух разных молекул РНК, например, от двух разных вирусов.
«Мы продвинули наше фундаментальное исследование дальше, найдя другие гомологи семейства Cas13a с иными нуклеотидными предпочтениями. Это позволяет проводить одновременную детекцию разных репортеров, скажем, с красным и зелёным флуоресцентным сигналом, создавая мультиплексную ферментативную систему детекции», — заявила первый автор Александра Ист-Селетски, аспирант лаборатории Дженнифер Даудны.
Ист-Селетски, Даудна и их коллеги сообщат о результатах 4 мая в журнале Molecular Cell.
Механизм действия
Белок Cas13a связывается со специфическими последовательностями РНК и не только разрезает эту целевую РНК, но и начинает бесконтрольно разрушать всю РНК поблизости.
«Думайте о связывании Cas13a с его РНК-мишенью как о переключателе "вкл/выкл" — связывание с мишенью включает фермент, и он превращается в Pac-Man'а в клетке, пожирая всю РНК вокруг», — пояснила Ист-Селетски. Этот «разгул» может убить клетку.
Исследователи предполагают, что такая активность Cas13a является его основной функцией в бактериях, направленной на уничтожение инфекционных вирусов (фагов). Как часть иммунной системы, она позволяет заражённым клеткам совершать суицид, спасая другие микробы от инфекции.
Учёные проанализировали базы данных бактериальных геномов, нашли 10 других Cas13a-подобных белков, синтезировали их и изучили их способность находить и разрезать РНК. Семь из них были похожи на исходный Cas13a, а три отличались сайтом разрезания. РНК состоит из четырёх нуклеотидов: аденина (A), цитозина (C), гуанина (G) и урацила (U).
«Опираясь на нашу первоначальную работу, мы теперь показываем, что можно мультиплексировать эти ферменты вместе, расширяя возможности технологии», — сказала Ист-Селетски. «В семействе CRISPR-Cas13a существует огромное разнообразие, которое можно использовать для многих приложений, включая детекцию РНК».
Дженнифер Даудна отметила, что детекция инфекционной РНК может требовать или не требовать стадии амплификации, которая является сложным шагом.
«Наша цель — разработать семейство ферментов Cas13a для диагностики у постели больного, которая была бы надежной и простой в применении», — сказала Даудна.