Команда расширила область применения более компактного CRISPR-Cas9

Исследователи из Массачусетской больницы общего профиля (MGH) показали, что разработанный ими метод для повышения полезности и точности наиболее распространённой формы инструментов для редактирования генов CRISPR-Cas9 можно применить к ферментам Cas9 из других бактериальных источников. В статье, опубликованной онлайн в Nature Biotechnology, команда сообщает о создании варианта SaCas9 — фермента Cas9 из бактерии Streptococcus aureus — который распознаёт более широкий спектр нуклеотидных последовательностей. Это позволяет нацеливаться на участки генома, ранее недоступные для технологии CRISPR-Cas9.

«Разработка вариантов Cas9 с более широким диапазоном нацеливания особенно важна для приложений, требующих точного таргетинга геномных последовательностей», — говорит Бенджамин Кляйнстивер, доктор философии, ведущий и соавтор статьи.

Кроме того, кодирующая последовательность SaCas9 на 23% меньше, чем у SpCas9 — версии из Streptococcus pyogenes. Это различие в размерах делает SaCas9 преимущественным для потенциальных терапевтических применений, требующих доставки с помощью вирусов.

CRISPR-Cas9 нуклеазы состоят из короткой молекулы РНК (20 нуклеотидов которой соответствуют целевой последовательности ДНК) и бактериального фермента Cas9, который разрезает ДНК в нужном месте. Помимо соответствия между РНК и ДНК, Cas9 должен распознавать соседнюю нуклеотидную последовательность, называемую PAM (protospacer adjacent motif).

В предыдущем исследовании команда MGH описала генетическую систему, позволившую быстро эволюционировать SpCas9 для распознавания различных последовательностей PAM. Естественный SpCas9 распознаёт PAM-последовательность вида NGG (где N — любой нуклеотид, а G — гуанин). Команде удалось создать версии SpCas9, распознающие более широкий спектр PAM-последовательностей, что удвоило диапазон доступных для таргетинга сайтов.

В текущем исследовании команда обратилась к SaCas9, которому естественным образом требуется PAM-последовательность NNGRRT (где R может быть аденином или гуанином, а T — тимином). Используя усовершенствованную версию системы молекулярной эволюции, команда MGH создала вариант под названием KKH SaCas9. Он распознаёт PAM-последовательности с любым нуклеотидом на третьей позиции, что увеличивает диапазон нацеливания в 2–4 раза.

Система позволила создать эти изменения в специфичности PAM без необходимости предварительного знания точной структуры фермента SaCas9, которая на момент исследования была неизвестна.

«Мы показали, что наш подход направленной эволюции можно использовать для изменения специфичности PAM у SaCas9, значительно расширив количество геномных сайтов, доступных для этой важной нуклеазы Cas9», — говорит Дж. Кит Джоунг, доктор медицины и философии, соавтор статьи.

«Мы считаем, что наш подход направленной эволюции предоставляет важную основу для изменения свойств распознавания множества нуклеаз Cas9, существующих во многих бактериях».