Исследователи создали варианты CRISPR-Cas9 нуклеаз с новыми свойствами
Исследователи из Массачусетской больницы общего профиля (MGH) разработали способ расширить применение и точность мощных инструментов редактирования генов — CRISPR-Cas9 РНК-управляемых нуклеаз. В статье, опубликованной онлайн в журнале Nature, они описывают полученные с помощью направленной эволюции версии фермента Cas9, способные распознавать иной спектр нуклеотидных последовательностей по сравнению с природной формой Cas9.
«Мы показываем, что сайты в генах человека и рыбки данио, которые ранее нельзя было модифицировать с помощью дикого типа Cas9, теперь можно редактировать с помощью созданных нами новых вариантов», — говорит ведущий автор работы Бенджамин Кляйнстивер. Это позволит исследователям нацеливаться на более широкий диапазон участков в различных геномах, что важно для задач, требующих высокой точности.
Система CRISPR-Cas9 состоит из бактериального фермента Cas9 и короткой 20-нуклеотидной РНК, комплементарной целевой ДНК. Помимо совпадения РНК/ДНК, ферменту Cas9 необходимо распознавать специфическую последовательность нуклеотидов — протоспейсер-смежный мотив (PAM), примыкающий к целевой ДНК. Наиболее часто используемая форма Cas9 из бактерии Streptococcus pyogenes (SpCas9) распознаёт PAM-последовательности, в которых за любым нуклеотидом следуют два остатка гуанина (GG). Это ограничивает редактирование только теми участками ДНК, которые содержат два последовательных гуанина.
Чтобы обойти это ограничение, команда MGH создала систему для быстрой направленной эволюции SpCas9, позволяющую ему распознавать другие PAM-последовательности. Из коллекции случайно мутировавших вариантов SpCas9 они выявили комбинации мутаций, которые позволили ферменту узнавать новые PAM. Эти эволюционировавшие варианты практически удваивают диапазон сайтов, доступных для редактирования с помощью SpCas9.
Кроме того, был идентифицирован вариант SpCas9 с повышенной специфичностью, который с меньшей вероятностью вызывает нецелевые мутации — проблема, впервые описанная в 2013 году группой под руководством старшего автора текущего исследования Дж. Кита Джунга. «Этот вариант должен быть немедленно полезен всем исследователям, использующим дикий тип SpCas9, и снизит частоту нежелательных мутаций», — отмечает Джунг.
«Возможно, что более важно, наша работа впервые демонстрирует, что активность SpCas9 можно изменять с помощью направленной эволюции белка. Мы также показываем, что формы Cas9 из двух других бактерий — Staphylococcus aureus и Streptococcus thermophilus — также могут функционировать в нашей системе, что предполагает возможность модификации и их свойств. Это лишь начало в расширении диапазона PAM, на которые может нацеливаться Cas9. Мы полагаем, что и другие важные свойства фермента можно изменить аналогичным подходом», — добавляет Джунг.