Новые варианты CRISPR-Cas9 могут реагировать на вирусные протеазы

Исследователи из Калифорнийского университета в Беркли с помощью техники циклической перестановки создали новый набор вариантов Cas9, названных Cas9-CPs. Это упростит разработку Cas9-фузионных белков для различных применений, выходящих за рамки простого разрезания ДНК, таких как редактирование оснований и эпигенетические модификации. Работа опубликована 10 января в журнале Cell.

В ходе того же процесса ученые превратили "всегда активные" молекулы Cas9 в активируемые переключатели, которые остаются в положении "выключено" до активации ферментами-протеазами. Полученные протеаз-чувствительные Cas9 (ProCas9) могут снизить нецелевые эффекты и позволить молекулярное зондирование, а также ткане- или органо-специфичное редактирование генома. Исследователи показали, что ProCas9 можно использовать для детекции вирусных протеаз, потенциально создавая систему обнаружения патогенов, способную запускать иммунный ответ.

"Мы не ограничены тем, что дала нам природа в отношении белков для редактирования генома", — говорит старший автор Дэвид Сэвидж, биохимик из Калифорнийского университета в Беркли. — "Эти белки можно тщательно оптимизировать и превратить в каркасы, обладающие нужными свойствами для использования в человеческих клетках".

Белки CRISPR-Cas, такие как Cas9, — это ферменты, защищающие бактерии от вторжения вирусов. Эта бактериальная система защиты была перепрофилирована для приложений по редактированию генома, например, инактивации генов, в различных типах клеток и организмах. Однако Cas9 эволюционировал как бактериальная защитная система и не обязательно обладает желательными свойствами для редактирования генома в клетках млекопитающих, такими как высочайшая точность таргетирования или возможность контролировать пространственную и временную активность фермента.

Хотя Cas9-фузионные белки были созданы для эффективного редактирования нуклеотидов в ДНК или активации/репрессии транскрипции через эпигенетические модификации, каждое новое применение требует углубленного инженерного подхода с трудоемкой оптимизацией. Другая серьезная проблема — Cas9 всегда находится в положении "включено". Это отсутствие контроля над активностью белка затрудняет таргетирование конкретных клеток или тканей, может приводить к непреднамеренному редактированию генома и большему нецелевому повреждению, а также препятствует использованию Cas9 в качестве молекулярного регистратора клеточных событий.

Чтобы преодолеть эти препятствия, команда Сэвиджа использовала циклическую перестановку для перепроектирования молекулярной последовательности Cas9, добившись лучшего контроля над его активностью и создав более оптимальный ДНК-связывающий каркас для фузионных белков. Этот подход включает соединение концов белка (N- и C-концов) пептидным линкером с одновременным разрывом его последовательности в другой позиции для создания новых, соседних N- и C-концов.

Исследователи обнаружили, что Cas9 высоко податлив к циклической перестановке. Несколько областей белка содержат "горячие точки", которые можно разорвать во многих позициях, чтобы генерировать разнообразие Cas9-CPs, способных служить каркасами для продвинутых фузионных белков. В настоящее время N- и C-концы Cas9 фиксированы и расположены неидеально для доступа фузионных белков к ДНК. В отличие от этого, концы новых белковых каркасов расположены ближе к интерфейсу взаимодействия с ДНК и оптимизированы для эффективной сборки фузионных белков.

Затем ученые создали ProCas9, сконструировав пептидный линкер так, чтобы он был достаточно коротким для перевода белка в неактивное состояние, и введя последовательности, которые могут быть разрезаны соответствующими вирусными протеазами. Эти ProCas9 были настроены для работы как "альтруистические" защитные системы, способные обнаруживать и реагировать на патогены, вызывая массированное повреждение ДНК и гибель инфицированных клеток при активации через разрезание линкерного пептида.

"Я могу представить различные биомедицинские приложения, где Cas9-CPs и ProCas9 позволят нам лучше понять процессы заболеваний, а также обеспечат более безопасные трансляционные применения CRISPR-Cas для редактирования и модификации генома", — говорит соавтор Кристоф Феллман из Калифорнийского университета в Беркли.

В будущих исследованиях команда планирует разрабатывать Cas9-фузионные белки для редактирования оснований и эпигенетических модификаций. Кроме того, они намерены проверить, можно ли использовать ProCas9 для построения целой синтетической иммунной системы. Также возможно создание ProCas9, чувствительных к эндогенным протеазам, для таргетирования специфичных клеток, например, для редактирования геномов раковых клеток. "Наша система ProCas9 полезна в любом случае, когда контроль над Cas9 был бы полезен", — говорит Сэвидж.