Высокоточный CRISPR-Cas9 не обнаруживает побочных мутаций

Новая модификация нуклеазы CRISPR-Cas9 для редактирования генов, по всей видимости, надежно устраняет нежелательные разрывы ДНК вне целевого участка (off-target), которые являются существенным текущим ограничением технологии, снижая их до необнаруживаемого уровня. В отчете, опубликованном онлайн в журнале Nature, исследователи из Массачусетской больницы общего профиля (MGH) описывают, как изменение фермента Cas9 для уменьшения неспецифических взаимодействий с целевой ДНК может значительно расширить области применения технологии редактирования генов.

Используемые для создания целевых разрывов ДНК, в которые можно вносить генетические изменения, нуклеазы CRISPR-Cas9 объединяют бактериальный фермент, разрезающий ДНК, под названием Cas9, с короткой направляющей РНК (guide RNA), способной связываться с целевой последовательностью ДНК. Однако CRISPR-Cas9 может вызывать нецелевые разрывы ДНК на участках, похожих на целевой.

Исследователи из MGH предположили, что уменьшение взаимодействий между Cas9 и целевой ДНК может полнее устранить побочные эффекты, сохранив при этом желаемое целевое взаимодействие. Команда сосредоточилась на том факте, что определенные части самого фермента Cas9 могут взаимодействовать с остовом молекулы целевой ДНК. Команда изменила четыре таких контакта, опосредованных Cas9, заменив длинные боковые цепи аминокислот, которые связываются с остовом ДНК, на более короткие, неспособные к таким соединениям.

Протестировав 15 возможных вариантов, исследователи обнаружили, что один вариант с тремя и один с четырьмя заменами демонстрируют наибольшее обещание в различении несовпадающих целевых сайтов при сохранении полной активности на целевом участке в человеческих клетках.

Четырехзамещенный вариант был назван SpCas9-HF1 (Sp для бактерии Streptococcus pyogenes, источника широко используемого Cas9, и HF для высокой точности — high-fidelity). Этот вариант вызывал целевые эффекты, сопоставимые с исходным неизмененным SpCas9, при использовании с более чем 85% из 37 различных направляющих РНК.

Используя систему GUIDE-Seq, высокочувствительный метод, разработанный лабораторией Joung в 2014 году для обнаружения побочных эффектов CRISPR-Cas9 по всему геному, команда обнаружила, что, в то время как нуклеазы с неизмененным SpCas9 и семью разными направляющими РНК вызывали до 25 побочных мутаций, использование SpCas9-HF1 не давало обнаруживаемых побочных эффектов с шестью из этих РНК и только один побочный сайт — с седьмой.

Команда Joung также обнаружила, что SpCas9-HF1 может снижать побочные эффекты при нацеливании на атипичные участки ДНК, характеризующиеся повторяющимися последовательностями из одного или двух нуклеотидов. Они разработали дополнительные производные от SpCas9-HF1 — HF2, HF3 и HF4, — которые смогли устранить немногочисленные остаточные побочные эффекты, сохранявшиеся у варианта HF1 с небольшим количеством направляющих РНК.

Исследователи также показали, что SpCas9-HF1, как и его природный аналог, можно комбинировать с другими полезными изменениями, расширяющими его полезность. Введение тех же изменений в SpCas9-HF1 также расширило диапазон мишеней для высокоточного варианта.