Эволюция более универсального CRISPR-Cas9

Фермент Cas9 и другие ферменты семейства CRISPR имеют ограничения. Для распознавания и связывания с целевой последовательностью ДНК Cas9 нуждается в специфическом мотиве из нуклеотидов рядом с мишенью. Это требование делает большую часть генома недоступной для фермента, что значительно сужает спектр его применения.

Исследователи из Broad Institute MIT и Гарварда, Гарвардского университета и Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI) создали новые варианты Cas9, совместимые с более широким спектром требуемых нуклеотидных мотивов, открыв доступ к большему числу участков генома. Более того, эти новые версии белка редактируют свои мишени с гораздо более высокой точностью, чем предыдущие.

Результаты опубликованы на этой неделе в журнале Nature.

Проблема PAM

Традиционно требуемая Cas9 последовательность нуклеотидов называется PAM (protospacer-adjacent motif). Если PAM отсутствует рядом с интересующим участком генома, природные CRISPR-ферменты не могут получить к нему доступ. Даже самый универсальный из известных ферментов Cas9 — SpCas9 из бактерии Streptomyces pyogenes — не может получить доступ почти к 95% генома. Это включает около трех четвертей однонуклеотидных мутаций, связанных с заболеваниями человека.

Эволюция in vitro с помощью PACE

Для создания вариантов SpCas9 с большим выбором PAM команда использовала систему фаг-ассистированной непрерывной эволюции (PACE), разработанную в лаборатории Дэвида Лю в Гарварде в 2011 году. В этой системе фаги несли ген Cas9 в бактерии, а бактерии, в свою очередь, копировали и мутировали ДНК Cas9. Система была сконструирована так, что фаги могли реплицироваться только в том случае, если ген Cas9 приобретал мутации, дающие способность связывать дополнительные PAM.

PACE работает более чем в 100 раз быстрее других методов эволюции белков. В результате было получено множество лабораторно-эволюционировавших форм Cas9, или «xCas9».

Результаты: больше доступа и выше точность

Наиболее оптимальный вариант xCas9 открыл доступ к участкам примерно в четверти генома, включая почти 75% точковых мутаций, связанных с заболеваниями человека. Исследователи продемонстрировали работу xCas9 в различных приложениях: активации генов, разрезании ДНК и редактировании отдельных пар оснований.

Самое удивительное, что xCas9, получив доступ к большему числу сайтов в геноме, совершал гораздо меньше ошибок (внецелевых редактирований), чем природный SpCas9.

Будущие направления

Исследователи сотрудничают с другими лабораториями, чтобы определить молекулярную основу повышенной специфичности xCas9 к ДНК, и продолжают использовать платформу PACE для эволюции новых вариантов ферментов с дополнительной совместимостью с PAM.

Цель — создать обширную «библиотеку» решений на основе Cas9 или других CRISPR-ферментов, чтобы получить доступ к каждому возможному сайту в геноме человека.