Компактный фермент Cas9d — перспективный инструмент для редактирования генома
Исследовательская группа под руководством профессора Ван Яньли из Института биофизики Китайской академии наук раскрыла структуру и механизм высокоактивного Cas9 типа II-D, предложив новый перспективный инструмент для редактирования генома. Исследование было опубликовано 11 августа в журнале Nature Communications.
Cas9 — это характерный белок систем CRISPR-Cas типа II, при этом Cas9 из Streptococcus pyogenes (SpCas9) наиболее широко используется благодаря высокой эффективности разрезания и надежной работе при редактировании генома. Однако его большая молекулярная масса ограничивает доставку с помощью векторов на основе адено-ассоциированного вируса (AAV). Поэтому поиск естественных или созданных вариантов Cas9 с меньшим размером молекулы, но сопоставимой активностью разрезания, стал важной задачей.
В этом исследовании ученые сосредоточились на Cas9 типа II-D, полученном из бактерии Nitrospirae (NsCas9d), который состоит всего из 762 аминокислот. Используя метагеномные наборы данных, исследователи идентифицировали повторы CRISPR и спейсеры, связанные с NsCas9d, и разработали соответствующую sgRNA.
In vitro тесты на расщепление показали, что NsCas9d требует по крайней мере 20-нт спаривания между субстратной двуцепочечной ДНК и sgRNA для достижения надежной активности расщепления двуцепочечной ДНК, сравнимой с активностью SpCas9.
Анализ истощения PAM в сочетании с высокопроизводительным секвенированием показал, что NsCas9d распознает последовательность PAM 5′-NRG-3′, при этом PAM 5′-NGG-3′ демонстрирует самую высокую эффективность расщепления in vitro.
Исследователи также определили крио-ЭМ структуру тройного комплекса NsCas9d-sgRNA-дцДНК с разрешением 2.86 Å, что стало первым сообщением о полной структуре доменов HNH и RuvC для Cas9 типа II-D.
В структурной модели последовательность PAM дцДНК размещается в положительно заряженном связывающем канале, образованном доменами PI и WED. Важно отметить, что NsCas9d генерирует продукты расщепления с 3-нт 5′-выступами («липкими концами»), что может повысить эффективность и предсказуемость процессов репарации ДНК во время операций редактирования генов, таких как вставки.
Это исследование не только углубляет понимание эволюции и молекулярных механизмов Cas9, но также подчеркивает потенциал NsCas9d как компактного и эффективного инструмента для применения в редактировании генома.