Учёные представили самый маленький на сегодняшний день член семейства CRISPR-Cas9
Учёные из Центра геномной инженерии Института фундаментальных наук (IBS) в сотрудничестве с коллегами разработали самый маленький на сегодняшний день CRISPR-Cas9, доставили его в мышечные клетки и глаза мышей с помощью адено-ассоциированных вирусов (AAV) и использовали для модификации гена, вызывающего слепоту. Опубликованная в Nature Communications система CRISPR-Cas9, происходящая из Campylobacter jejuni (CjCas9), может стать полезным терапевтическим инструментом против распространённых и «неподдающихся лечению» мишеней болезней.
CRISPR-Cas9 — это инновационная, дешёвая и точная техника редактирования генов. Белок Cas9 создаёт разрезы в целевом гене. Для доставки комплекса CRISPR-Cas9 к целевой ДНК используются плазмиды или вирусы. «AAV — это эффективный и безопасный вектор для экспрессии интересующего гена in vivo, широко используемый в генной терапии», — поясняет КИМ Джин-Су, директор Центра.
Наиболее распространённая версия техники использует Cas9 из бактерии Streptococcus pyogenes. Однако этот белок состоит из 1368 аминокислот и слишком велик для доставки и упаковки в AAV. Cas9 из Staphylococcus aureus также используется для редактирования генов. Он немного меньше (1053 аминокислоты), но не оставляет достаточно места для других белков.
В этом исследовании команда обнаружила, что CjCas9 эффективен и мал. Он состоит из 984 аминокислот и может быть упакован в AAV вместе с более чем одной направляющей РНК, а также с флуоресцентным репортёрным белком.
Чтобы использовать бактериальный белок для редактирования генов, учёным пришлось оптимизировать некоторые аспекты техники. Они разработали короткую последовательность ДНК сразу после целевой последовательности ДНК, называемую мотивом, прилегающим к протоспейсеру (PAM). Каждому различному Cas9 нужна специфическая последовательность PAM. Кроме того, им пришлось модифицировать длину направляющей РНК.
Затем учёные упаковали новый комплекс CRISPR-Cas9 в AAV вместе с двумя направляющими РНК и флуоресцентным репортёрным белком, чтобы мутировать гены в мышцах и глазах мышей. Они сосредоточились на двух генах, участвующих в возрастной макулярной дегенерации (ВМД), одной из основных причин слепоты у взрослых. Один ген — распространённая терапевтическая мишень для ВМД, называемая фактором роста эндотелия сосудов A (VEGF A), другой — фактор транскрипции HIF-1a, активирующий транскрипцию VEGF A.
В отличие от VEGF A, HIF-1a не считался мишенью для лекарств. Так называемые «неподдающиеся лечению» гены, такие как факторы транскрипции, не могут быть нацелены напрямую антителами и другими биологическими или химическими препаратами. В этом исследовании команда доказала, что CjCas9, доставленный в сетчатку через AAV, может эффективно инактивировать Hif1a и VEGF A у мышей и уменьшить площадь хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ).
«CjCas9 высокоспецифичен и не вызывает внецелевых мутаций в геноме», — объясняет КИМ Джин-Су.
Последовательности-мишени гена Hif1a одинаковы у мышей и людей, поэтому метод, представленный в этом исследовании, может быть использован в будущем для лечения ВМД у пациентов. Прокладывая путь к применению CjCas9 против «неподдающихся лечению» генов или некодирующих последовательностей, эта технология может расширить спектр терапевтических мишеней, делая весь человеческий геном потенциально доступным для лекарственного воздействия.