Определение лизоцима

Методы определения лизоцима основаны на измерении изменений оптической плотности стандартной суспензии живых клеток Micrococcus lysodeikticus (штамм 2665) или изготовленного из них ацетонового порошка под действием лизоцима, содержащегося в исследуемой биологической жидкости. Изменения фиксируют с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК-М) или спектрофотометра (СФМ).

Метод О. В. Бухарина (1971)

  1. В опытную пробирку вносят:
    • 0,4 мл фосфатного буфера (1/15 М, pH 6,2);
    • 0,1 мл исследуемой сыворотки;
    • 2 мл взвеси суточной агаровой культуры микрококка на том же буфере с оптической плотностью 0,66 (измеренной на ФЭК-М по левому барабану).
  2. Смесь инкубируют при 37 °C в течение 30 минут.
  3. Оптическую плотность измеряют на ФЭК-М по правому барабану с зелёным светофильтром.
  4. Полученный показатель сравнивают с калибровочной кривой.

Активность лизоцима выражают в мкг/мл.

Метод Л. П. Титова (1978)

Этот метод пригоден для определения содержания лизоцима в любых биологических жидкостях, но требует наличия спектрофотометра (СФМ) с термостатирующей камерой и записывающим устройством.

  1. В кювету СФМ (10×10 мм, объёмом 3 мл) последовательно вносят:
    • 1,5 мл 0,05% взвеси ацетонового порошка микрококка на фосфатном буфере (1/15 М);
    • 0,5 мл 0,3 М раствора хлорида натрия;
    • 0,5 мл цельной или разведённой исследуемой жидкости.
  2. Содержимое перемешивают тефлоновой палочкой.
  3. Кювету помещают в термостат спектрофотометра и на 90–120 секунд включают записывающее устройство.
  4. Определяют тангенс угла наклона полученной кинетической кривой и по калибровочному графику устанавливают активность лизоцима в мкг/мл.

Важно: Поскольку активность лизоцима по отношению к разным субстратам неодинакова, в предварительном опыте необходимо подобрать оптимальное соотношение между концентрацией субстрата и фермента.

Референсные значения (по методу Титова):

  • У здоровых людей средняя активность лизоцима в сыворотке крови составляет 10,66 ± 0,34 мкг/мл.
  • В носовой слизи — 76,67 ± 4,81 мкг/мл.

Также для определения лизоцима предложен метод диффузии в агаре.

Современный контекст

Описанные методы, основанные на лизисe клеток Micrococcus lysodeikticus, долгое время были классическими. Сегодня, наряду с ними, широко применяются более чувствительные и специфичные методы:

  • Иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий напрямую определять концентрацию белка лизоцима.
  • Флуориметрические методы с использованием специфических субстратов.
  • Автоматизированные хемилюминесцентные анализаторы.

Эти современные методики часто включены в стандартные панели для исследования биологических жидкостей, что упрощает и ускоряет процесс анализа.