Новый метод выделения интактных лизосом из клеточных культур

Корректная работа клеток зависит от точной координации множества сложных процессов и органелл. Лизосомы — жизненно важные клеточные органеллы — это заполненные ферментами субъединицы, которые помогают расщеплять и повторно использовать макромолекулы (белки, липиды, нуклеотиды). Помимо функции в клеточном пищеварении и утилизации отходов, лизосомы участвуют в аминокислотной сигнализации, стимулирующей синтез белка.

Поскольку многие заболевания вызваны дефектами функции лизосом, исследователи десятилетиями пытаются их изучить. Однако существует лишь несколько методов выделения лизосом из клетки. Самый распространенный — «ультрацентрифугирование в градиенте плотности». Он подразумевает мягкое разрушение клеточной мембраны и центрифугирование содержимого клетки для разделения компонентов по плотности. К сожалению, некоторые другие органеллы имеют ту же плотность, что и лизосомы, что приводит к загрязнению образцов. Кроме того, процесс занимает так много времени, что многие лизосомальные белки к его окончанию теряются или деградируют.

Более продвинутая техника — «иммунопреципитация» — основана на модификации поверхностных белков лизосом для их захвата магнитными шариками с антителами. Хотя этот подход дает более чистые результаты, белковый состав извлеченных лизосом изменяется процедурой, что может исказить последующий анализ. Очевидна необходимость в лучшем методе выделения лизосом.

Группа ученых под руководством профессора Синья Мэнозоно из Японского передового института науки и технологий (JAIST) разработала новую стратегию быстрого выделения интактных лизосом с высокой чистотой. Исследование опубликовано в ACS Nano.

Основа метода: магнитоплазмонные наночастицы

Стратегия основана на использовании гибридных магнитоплазмонных наночастиц (MPNPs) из серебра и железо-кобальтового сплава, покрытых соединением амино-декстран (aDxt). Эти частицы естественным образом поглощаются клетками путем эндоцитоза, который завершается внутри лизосом. После накопления достаточного количества MPNPs внутри лизосом клетки можно мягко разрушить, а лизосомы извлечь с помощью магнитов.

Ключ к чистоте: визуализация и синхронизация

Для успеха метода критически важно, чтобы MPNPs находились только внутри лизосом, а не в других органеллах. Здесь помогает плазмонная визуализация: плазмонные наночастицы особым образом взаимодействуют со светом, что позволяет легко наблюдать их в оптический микроскоп. Используя иммуноокрашивание для маркировки разных органелл эндоцитарного пути, исследователи определили точное время, за которое большинство MPNPs достигает лизосом. Это гарантирует высокую чистоту образцов.

Скорость — главное преимущество

Команда проанализировала влияние температуры и времени магнитного разделения на белковый состав выделенных лизосом. Результаты показали, что потеря белка происходит очень быстро, даже при температуре 4°C. Однако новый метод оказался достаточно быстрым для выделения интактных лизосом.

«Мы выяснили, что максимальное время, необходимое для выделения лизосом после разрушения клеток, составляет 30 минут, что существенно меньше времени, требуемого для методов на основе центрифугирования, которым обычно требуется минимум несколько часов», — отмечает профессор Мэнозоно.

Значение и перспективы

Новая техника позволит исследовать хрупкие метаболиты лизосом и их изменения в ответ на стимулы, что приблизит к пониманию заболеваний, связанных с дисфункцией лизосом.

«Учитывая глубокую связь лизосом со многими клеточными метаболитами, более глубокое понимание их функции необходимо для определения ее регуляции в разных клеточных состояниях. Таким образом, наш метод может способствовать лучшему пониманию и лечению лизосомальных болезней в будущем», — заключает профессор Мэнозоно.

Кроме того, этот подход можно модифицировать для выделения и других органелл, кроме лизосом.