Фаготипирование

Фаготипирование — это метод определения принадлежности выделенной и идентифицированной до вида бактериальной культуры к определённому фаговару (фаговому варианту). Используют два подхода.

Сущность первого подхода состоит в установлении свойств фагов, полученных из лизогенной культуры (например, литического спектра, антигенной специфичности и других).

Сущность второго, более распространённого, подхода базируется на выявлении спектра чувствительности выделенной культуры к набору стандартных типовых фагов. Если фаговар культуры соответствует типовому фагу, наступает лизис бактерий, проявляющийся в отсутствии их роста, в то время как на месте нанесения других фагов наблюдается сплошной рост микробов.

Для фаготипирования необходимы:

  • Молодая (4–6-часовая) культура исследуемого штамма, идентифицированного до вида или подвида.
  • Набор стандартных типовых фагов в критических тест-разведениях (в максимальном разведении фага, вызывающем сплошной лизис гомологичной культуры).
  • Чашки Петри со стандартной свежеприготовленной и хорошо высушенной питательной средой.

Культуру засевают сплошным газоном на чашку с питательной средой, дают ей впитаться в агар, и на поверхность посева пастеровской пипеткой, штампом-репликатором или калиброванной петлёй наносят капли типовых фагов. На второй день учитывают спектр чувствительности культуры к фагам и сопоставляют его со схемой фаготипирования. Результаты используют для эпидемиологического анализа.

Фаготипирование применяют для типирования Salmonella typhi, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae и других бактерий.

Фагоцитарные реакции

Фагоцитарные реакции — это пробирочные иммунные реакции, основанные на взаимодействии фагоцитов с микроорганизмами при участии или без участия системы комплемента и антител. Их используют для выяснения общей активности фагоцитарной реакции и функционирования отдельных её этапов: хемотаксиса, опсонизации, прикрепления, захвата, умерщвления и переваривания.

Для оценки фагоцитарной активности обычно применяют:

  1. Фагоцитарный индекс Гамбургера (ФИ) — процент фагоцитов, принимающих участие в фагоцитозе.
  2. Фагоцитарное число Райта (ФЧ) — среднее число захваченных одним фагоцитом частиц.
  3. Показатель фагоцитарной способности крови индивида (ПФС) — произведение ФИ и ФЧ на число лейкоцитов или моноцитов в 1 мкл крови.
  4. Показатель завершённости фагоцитоза.
  5. Другие показатели, например, НСТ-тест (тест восстановления нитросинего тетразолия).

Методика постановки реакции

Для постановки фагоцитарных реакций берут очищенную суспензию лейкоцитов человека или цельную кровь. В качестве антикоагулянта в обоих случаях предпочтительнее использовать гепарин.

В качестве объекта фагоцитоза в зависимости от задач исследования применяют:

Лучше брать живые культуры стандартных штаммов золотистого и белого стафилококка и кишечной палочки, поскольку они позволяют выявить важнейший показатель фагоцитоза — его завершённость. Для опыта необходимы отмытые от среды суточные агаровые культуры плотностью 0,2–2 млрд микробных тел/мл при исследовании фагоцитарной активности полинуклеаров и 10 млн микробных тел/мл — при исследовании мононуклеаров.

В качестве разбавителя желательно применять раствор Хенкса (pH 6,5–7,2) с 10% сыворотки крови здорового человека, не содержащей антител к исследуемому микробу. Для опсонофагоцитарной реакции необходима иммунная сыворотка.

Соотношение лейкоцитов и микробов, а также время контакта определяют в зависимости от задач в предварительных опытах. Рекомендуемое соотношение — от 1:1 до 1:100, экспозиция — от 5 минут до 3 часов.

Постановка реакции с цельной кровью

  1. Взятую из пальца в стерильные пробирки с гепарином кровь разводят раствором Хенкса (1:20).
  2. Центрифугируют 5 минут при 800 g.
  3. Надосадочную жидкость сливают, осадок разбавляют раствором Хенкса до прежнего объёма.
  4. В нескольких пробирках готовят смеси из 0,5 мл суспензии лейкоцитов и 0,5 мл отмытой от среды суспензии микроорганизмов в растворе Хенкса плотностью 100 млн микробных тел/мл.
  5. Смесь инкубируют при 37 °C.
  6. Через 15, 30, 45 минут одну из пробирок центрифугируют 5 минут при 800 g.
  7. Из осадка готовят мазки, фиксируют их смесью Никифорова и окрашивают водным раствором метиленового синего или по Романовскому — Гимзе.
  8. Подсчитывают фагоцитарный индекс и фагоцитарное число, а исходя из этих данных и количества лейкоцитов в 1 мкл — показатель фагоцитарной способности. Важно определить также скорость фагоцитарной реакции.

Методика определения фагоцитарной активности с отмытой взвесью лейкоцитов отличается от описанной только первым этапом, в котором готовят взвесь очищенных лейкоцитов в растворе Хенкса с гепарином плотностью 2–10 млн/мл. Предложено много других методов постановки фагоцитарных реакций.

Современный контекст

Фаготипирование, описанное в оригинальном тексте, долгое время было золотым стандартом для эпидемиологического типирования бактерий, особенно в догеномную эру. Сегодня его в значительной степени заменили методы молекулярного типирования, такие как MLST (мультилокусное типирование по последовательностям), PFGE (электрофорез в импульсном поле) и, в особенности, полногеномное секвенирование (WGS). Эти методы обеспечивают более высокое разрешение, воспроизводимость и позволяют проводить глобальный эпидемиологический анализ. Однако фаготипирование до сих пор может использоваться в некоторых специализированных лабораториях или для исторического сравнения штаммов.

Оценка фагоцитарной активности остаётся важным инструментом в иммунологии и клинической диагностике, например, для выявления врождённых дефектов фагоцитоза (например, хронической гранулёматозной болезни). Современные методы часто используют проточную цитометрию, что позволяет более точно и быстро оценивать различные параметры фагоцитоза (поглощение, окислительный взрыв) на уровне отдельных клеток с использованием флуоресцентно меченых частиц или бактерий.