Липидные везикулы заменят эксперименты на мышах
Исследователи из ETH Zurich подали заявку на патент метода тестирования биологической активности одного из сильнейших известных токсинов — ботулинического нейротоксина. Если метод будет принят фармацевтической промышленностью, это может спасти жизни более полумиллиона мышей в год.
Ботулинический нейротоксин (BoNT), продуцируемый бактерией Clostridium botulinum, — один из сильнейших известных ядов. Он ингибирует передачу сигнала от нервных окончаний к мышцам, вызывая паралич и апноэ. Для смерти взрослого человека достаточно одного микрограмма на килограмм массы тела.
BoNT — известный пищевой токсин, иногда обнаруживаемый в недостаточно стерилизованных консервированных овощах. Однако микробы также могут размножаться в мясе и колбасах и продуцировать токсин. Бактериальные споры практически вездесущи, но могут прорастать и производить токсин только в среде с низким содержанием кислорода и некислой.
Более 100 различных медицинских применений
Тем не менее, ботулинический нейротоксин имеет и преимущества: с 1980-х годов он используется для лечения десятков хронических состояний, включая нервно-мышечные нарушения (кривошея), гипергидроз, косоглазие, мигрени и даже «теннисный локоть». А с 1990-х косметическая индустрия в огромных масштабах использует этот некогда страшный «колбасный яд» под брендом «Ботокс» для разглаживания морщин.
Однако использование BoNT — это игра с огнём. Токсин — природный продукт, производимый бактериями, но не с постоянной концентрацией и активностью. Поэтому регулирующие органы требуют тестировать токсичность каждой партии терапевтического агента, содержащего BoNT, с помощью теста LD50 на мышах, который определяет дозу, убивающую половину животных. Для таких рутинных тестов в фармацевтической промышленности ЕС и США ежегодно гибнет более полумиллиона мышей.
Создана система тестирования без животных
Новая тест-система, разработанная исследователем ETH Zurich Оливером Вайнгартом в сотрудничестве с лабораторией Шпиц, может теперь спасти этих мышей. Система впервые работает без лабораторных животных или живых клеток, измеряя токсическую активность нейротоксина с помощью искусственно созданных липидных мембранных везикул (липосом).
В Лаборатории пищевой микробиологии исследователи разработали реакционные компартменты, окружённые двойной липидной мембраной, имитирующей окончания нервных клеток. В липидную мембрану встроены специфические рецепторы нервных клеток, к которым ботулинический нейротоксин может связываться по принципу «ключ-замок». При подкислении окружающей среды структура токсина меняется так, что часть его проникает в липосому. Там токсин активируется и расщепляет репортёрный белок, присутствующий в пузырьке, который после расщепления начинает светиться. Эта флуоресценция напрямую связана с концентрацией BoNT: чем ярче липосомы, тем выше концентрация токсина.
Недорогой и простой в использовании анализ
Предлагаемая тест-система имеет очевидные преимущества. «Липосомы легко и недорого производить, и для работы с ними персоналу лаборатории не требуется специальной подготовки», — говорит Вайнгарт. Новая система также имеет другое преимущество, поскольку её можно модифицировать для тестирования биологической активности других токсинов, состоящих, как и BoNT, из разных субъединиц, включая токсины столбняка, дифтерии, Шига или холеры.
«Система очень чувствительна», — продолжает Вайнгарт. При использовании мышей предел обнаружения ботулинического нейротоксина составляет около десяти пикограмм. Цель — обнаруживать менее одного пикограмма токсина (одна миллиардная грамма) с помощью липосомного анализа. Система уже даёт первый сигнал через один-три часа, а окончательный результат доступен менее чем за двадцать четыре часа; тогда как с мышами это может занять до четырёх дней.
Было продемонстрировано, что система способна обнаруживать BoNT. «Мы предоставили доказательство концепции для нашей первоначальной идеи», — говорит Мартин Лёсснер, профессор пищевой микробиологии. Исследователи недавно начали стандартизировать тест и улучшать липосомы для обеспечения надёжных измерений.
Адаптируемая конструкция теста
В разработке новой тест-системы также участвуют исследователи из Медицинской школы Ганновера, компании miprolab GmbH (Гёттинген) и лаборатории Шпиц, где Вайнгарт начинал проект как аспирант, прежде чем присоединиться к группе профессора Лёсснера в качестве постдока. Вместе с Федеральным управлением гражданской защиты, к которому относится лаборатория Шпиц, исследователи подали патент для защиты интеллектуальной собственности на свою новую тест-систему.
До сих пор основное внимание уделялось потребностям фармацевтической промышленности. Однако Мартин Лёсснер и Оливер Вайнгарт также планируют расширить тест-систему для других применений. Например, можно было бы разработать аналогичный тест для питьевой воды или пищевых продуктов для обнаружения нейротоксинов.
В настоящее время проект финансируется в основном за счёт гранта Вайнгарту от «3R Research Foundation», которая стремится минимизировать, избегать и улучшать тестирование на животных и поддерживается защитниками животных и фармацевтической промышленностью. Поскольку фонд очень избирательно подходит к проектам, Вайнгарт справедливо считает свою стипендию значительной честью.