Исследование раскрывает работу сплайсосомы в реальном времени
Новый метод визуализации молекулярных машин во время их сложной работы по вырезанию и склеиванию генетической информации внутри ядра стал предметом статьи в журнале Science. Полученные "фильмы" выявили неожиданные детали процесса.
Мелисса Дж. Мур, доктор философии, исследователь Медицинского института Говарда Хьюза и профессор биохимии и молекулярной фармакологии в Медицинской школе Университета Массачусетса, вместе с коллегами из Университета Брандейса и Колумбийского университета долгое время изучала "сплайсосому" — комплекс специализированных РНК и белковых субъединиц, который действует как молекулярные ножницы и скотч во время транскрипции генов. Сплайсосома вырезает бессмысленные участки генов и сшивает оставшиеся части, создавая окончательные клеточные чертежи для производства каждого белка.
Без этого вырезания и вставки — "сплайсинга РНК" — количество генетической информации, которое мог бы содержать каждый ген, было бы крайне ограничено. Благодаря альтернативным схемам сплайсинга, которые создают разные чертежи, каждый из наших генов может кодировать множество белков. Отсюда критическая важность сплайсосомы.
"Понимание того, как эти микромашины функционируют внутри клетки, важно по многим причинам", — говорит Аарон А. Хоскинс, доктор философии, постдокторант в лаборатории Мура и первый автор статьи в Science. — "Одна — для дальнейшей расшифровки базовой биологии — того, что делает нас людьми, — а другая — чтобы понять, как возникают болезни, связанные с этими различными машинами".
Но сплайсосома настолько сложна, что единственный способ по-настоящему понять, как она работает, — это "заглянуть под капот", говорит Мур. Этому способствовал новый метод визуализации, использующий лазеры, флуоресцентную микроскопию и метод прикрепления цветных красителей к белкам, составляющим сплайсосому. Это позволяет ученым наблюдать за сборкой сплайсосомы в движении, в реальном времени. Это разница между просмотром фотографии оживленного перекрестка и фильма о том же перекрестке.
Статья "Ordered and Dynamic Assembly of Single Spliceosomes" опубликована в номере Science от 11 марта 2011 года и завершает пятилетнее сотрудничество трех исследовательских лабораторий с удивительно разнообразным опытом. Члены лаборатории Вирджинии Корниш на химическом факультете Колумбийского университета синтезировали специальные красители, которые присоединялись к белкам сплайсосомы. Джефф Геллес, профессор биохимии и молекулярной фармакологии в Университете Брандейса, является экспертом по ферментам, необходимым для работы крошечных молекулярных "моторов", таких как сплайсосома; его лаборатория разработала многолазерную систему визуализации, использованную для создания "фильмов" и открытий в этой работе.
Возможность наблюдать за сборкой сплайсосомы в реальном времени дает ученым мощный новый инструмент для понимания молекулярных процессов. То, что обнаружили Мур и коллеги, особенно удивительно. Изучая сплайсосомы в клетках дрожжей, они обнаружили, что в пути сборки "то, что обычно считалось улицей с односторонним движением, где сборка происходит шаг за шагом в одном направлении, на самом деле является улицей с двусторонним движением, с множеством тупиков".
То, что сборка сплайсосомы происходит упорядоченно, было понятно, но то, что каждый шаг в процессе оказывается обратимым, — нет. Не менее важно, что "фильмы" также показали, что ранние шаги сборки сплайсосомы не обязательно означают, что процесс начался и будет необратимо двигаться вперед. Скорее "приверженность" — вероятность того, что процесс сборки будет завершен после его начала, — увеличивается по мере развития процесса.
Существование обратимых шагов в сборке сплайсосомы, "тупики", которые могут остановить сборку до ее завершения, и увеличение приверженности по мере прогрессирования сборки — теперь это шаги, которые можно наблюдать в реальном времени в лаборатории. Таким образом, один из самых важных и наименее понятных генетических процессов — "альтернативный сплайсинг" — внезапно стал более понятным.
Как уже было известно, один человеческий ген должен содержать чертежи для более чем одного белка. Если бы это было не так, человеческий геном должен был бы быть во много раз больше. То, что гены кодируют множество белков, объясняет, как вся генетическая информация, необходимая для роста организма, достаточно мала, чтобы содержаться в каждой из его клеток. Это альтернативный сплайсинг, при котором РНК, произведенная во время транскрипции гена, повторно соединяется множеством способов и настраивает кодирование для нескольких белков.
Сколько? У человека более 95% генов альтернативно сплайсируются сплайсосомой. "Теперь у нас есть возможность снять в действии этого молекулярного портного, который вырезает и сшивает обрывки генов, чтобы создать разные белковые "наряды", требуемые различными типами клеток для выполнения их специфических функций", — сказала Мур.
Лазеры и цвета
Коллеги в лаборатории Джеффа Геллеса в Брандейсе кропотливо разработали способ использования лазеров для изучения сплайсосомы и ее действий. Ларри Фридман, старший научный сотрудник биохимического факультета Брандейса, потратил более пяти лет на разработку специализированных световых микроскопов для наблюдения за отдельными молекулами белков.
Чтобы увидеть сплайсосому в действии — как она собирается, чтобы фактически выполнить сплайсинг, — отдельные дрожжевые компоненты помечаются флуоресцентными красителями, затем образец помещается в микроскоп. Лазеры действуют как источник света, который заставляет отдельные меченые молекулы светиться, так что можно наблюдать в беспрецедентных деталях процесс сплайсинга на различных стадиях.
"Если у нас есть один компонент сплайсосомы с зеленым красителем и один с красным красителем, то, когда мы видим, как зеленое и красное пятна сходятся на РНК, мы знаем, что изучаем часть этого процесса сборки", — говорит Геллес. — "Наблюдая за отдельными молекулами по одной, мы можем фактически отслеживать стадии процесса сборки. Мы можем определить, происходит ли это в одном и том же порядке на каждой молекуле или некоторые сплайсосомы собираются иначе, чем другие".