Новая методика анализа взаимодействий РНК-РНК в живых микробных клетках
Группа профессора Чао Яньцзе из Шанхайского института иммунитета и инфекций Китайской академии наук представила новую технологию профилирования РНК-интерактома iRIL-seq для идентификации молекулярных взаимодействий РНК-РНК в живых микробных клетках. Исследование опубликовано в Nature Communications.
С помощью iRIL-seq учёные впервые построили сети РНК-интерактома бактерии Salmonella enterica на разных стадиях роста и обнаружили множество новых некодирующих РНК и важных регуляторных узлов мРНК.
Проблема и значение
Прямое взаимодействие РНК-РНК — основной механизм, с помощью которого некодирующие РНК выполняют свои функции. В прокариотических клетках малые некодирующие РНК (sRNA) распознают мишени-мРНК через очень короткие и несовершенные взаимодействия спаривания оснований, которые сложно предсказать и идентифицировать.
Бактериальные некодирующие РНК играют ключевую роль в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне, контролируя такие процессы, как бактериальная инфекция, устойчивость к антибиотикам, центральный метаболизм, стрессовый ответ, чувство кворума и формирование биоплёнок. Анализ сети РНК-РНК взаимодействий крайне важен для изучения физиологии микробов и функций некодирующих РНК.
Новая технология iRIL-seq
Существующие методы профилирования РНК-интерактома сложны, требуют фиксации клеток и многочисленных in vitro этапов (переваривание, репарация и лигирование РНК), что даёт недостаточное количество взаимодействий с низким разрешением и точностью.
Новый подход iRIL-seq (intracellular RNA interaction by ligation and sequencing) — это in vivo метод проксимального лигирования РНК. В живых микробных клетках индуцируют экспрессию T4 РНК-лигазы, которая катализирует проксимальное лигирование взаимодействующих молекул РНК in vivo. Затем с помощью иммунопреципитации основного шаперона малых РНК Hfq обогащают малые некодирующие РНК и их взаимодействующие транскрипты. Идентификацию и секвенирование взаимодействующих молекул РНК проводят с помощью высокопроизводительного секвенирования РНК.
Весь основной эксперимент можно завершить в течение одного дня благодаря быстрому лигированию in vivo и оптимизированному протоколу.
Результаты и открытия
Новая технология не только позволяет визуализировать атлас сети РНК-РНК взаимодействий микроба, но и идентифицировать взаимодействия спаривания оснований РНК-РНК с однонуклеотидным разрешением. iRIL-seq — простая, быстрая, точная и универсальная технология для анализа РНК-РНК взаимодействий у микроорганизмов, которая также предлагает новый путь для изучения таких взаимодействий в эукариотических клетках.
Исследователи впервые построили динамические РНК-интерактомы патогена Salmonella enterica на нескольких стадиях роста, идентифицировали более 2000 РНК-РНК взаимодействий и обнаружили множество ключевых регуляторных узлов мРНК. Крупнейшим на сегодня регуляторным узлом мРНК у бактерий оказалась мРНК, кодирующая порин внешней мембраны OmpD, которую регулируют по меньшей мере 12 различных малых некодирующих РНК.
Экспериментальная характеристика этих малых РНК привела к открытию новой малой РНК FadZ, которая отщепляется рибонуклеазой от 3'UTR мРНК. Экспрессия FadZ и её родительской мРНК fadBA регулируется вышестоящими транскрипционными факторами FadR, CRP и сигналами длинноцепочечных жирных кислот.
В условиях присутствия длинноцепочечных жирных кислот и малая РНК FadZ, и её ген-мишень ompD активируются транскрипционным фактором CRP, вместе формируя некогерентную петлю прямой связи типа I (I1-FFL). Это открытие раскрывает посттранскрипционный регуляторный механизм, с помощью которого бактерии реагируют на метаболизм длинноцепочечных жирных кислот в организме хозяина.