Улучшение редактирования генома для биоэнергетики

CRISPR-Cas9 — мощный инструмент для высокопроизводительного редактирования генов, который может помочь ученым конструировать организмы для применения в биоэнергетике. Cas9 нуждается в направляющей РНК (guide RNA), чтобы привести его к правильной последовательности для разрезания, но не все направляющие эффективны. Чтобы гарантировать, что инструмент редактирования сделает правильный разрез, исследователи создали набор направляющих РНК, эффективных против 94% генов у липид-продуктивных дрожжей.

Команда использовала этот набор направляющих РНК на Yarrowia lipolytica, чтобы идентифицировать существенные гены и гены, которые приводят к увеличению производства липидов. Эти данные о биологии Y. lipolytica и липидном метаболизме способствуют цели Министерства энергетики США (DOE) по производству устойчивого топлива из альтернативных источников. Более того, команда заявляет, что подход, использованный для валидации их набора направляющих РНК, может быть применен к другим нестандартным организмам.

В исследовании, опубликованном в Metabolic Engineering, команда исследователей, возглавляемая аспирантом Кори Шварцем и его научным руководителем Яном Уилдоном из Калифорнийского университета в Риверсайде, в сотрудничестве с Исследовательским институтом генома Министерства энергетики США (JGI), сначала «наточила свой инструмент».

Y. lipolytica — перспективная микробная фабрика, способная превращать обильные углеводы биомассы (глюкозу и ксилозу) в жирные кислоты для возобновляемого топлива. Липиды могут составлять более 90% сухого веса микроба.

Чтобы лучше использовать эту энергию, команда хотела нарушить работу каждого гена в геноме с помощью CRISPR-Cas9. Однако сначала нужно было решить проблему: направляющие РНК (sgRNA) могут быть неэффективными, что приводит к ложноотрицательным результатам.

Через Программу поддержки научных сообществ JGI ученые создали пул из шести sgRNA для каждого гена в геноме. Затем они провели скрининг на самых эффективных направляющих, используя штамм Y. lipolytica с нарушенным механизмом репарации ДНК. Эффективная sgRNA приводила Cas9 к летальному двуцепочечному разрыву ДНК, тогда как неэффективная была безвредна. Это позволило измерить эффективность sgRNA по летальности и выбрать только самые надежные для финального набора.

С готовым инструментом команда определила 1 377 (17,5%) генов Y. lipolytica как существенные для роста. Для сравнения, первоначальный скрининг с непроверенной библиотекой показал только 359 таких генов.

Также были выявлены четыре гена, приводящие к сверхпродукции липидов, включая один ген с ранее неизвестной функцией.

Успех проекта демонстрирует, как можно «наточить» инструмент CRISPR-Cas9 для нестандартного эукариотического организма — подход, применимый и к другим эукариотам.