Набор для сборки ДНК раскрывает потенциал CRISPR-Cas9 для метаболической инженерии
CRISPR/Cas9 — это революционный метод редактирования генома микробных клеток. Его ключевое преимущество — возможность бесшовной интеграции ДНК в хромосому без использования маркеров. Однако сборка таких систем сложна, что ограничивает их применение.
В новой статье в Nature Communications Biology команда под руководством Тиграна В. Юзбашева проанализировала ограничения существующих наборов инструментов Cas9 и объединила три проверенных метода в единый комплексный набор для эффективной метаболической инженерии с помощью CRISPR/Cas9. Набор включает 147 плазмид для создания и характеризации библиотеки из 137 промоторов для производства гомогентизиновой кислоты.
Геномные модификации с CRISPR/Cas9
Система CRISPR/Cas9 позволяет проводить быстрые, точные и бесследные геномные модификации, что открывает широкие возможности для конструирования микробных штаммов. Метаболическая инженерия дрожжей — это быстрорастущая область для устойчивого производства химикатов, топлива, продуктов питания и фармацевтических препаратов.
В данной работе команда определила три ключевых улучшения системы CRISPR/Cas9 для инженерии дрожжей:
- Простая смена между модификациями с маркером и без маркера.
- Быстрая замена участков гомологии для интеграции в разные локусы.
- Упрощенный метод клонирования гидовых РНК (gRNA).
Интеграция без маркера
Для интеграции без маркера команда использовала двухцепочечный разрыв, индуцированный Cas9, который репарируется с помощью донорной матрицы через гомологичную рекомбинацию. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae преобладает альтернативный путь репарации — негомологичное соединение концов (NHEJ). Чтобы усилить гомологичную рекомбинацию, в таких случаях можно удалить гены NHEJ. Если метод без маркера не срабатывает, система позволяет легко переключиться на интеграцию с маркером.
Перенаправление донорной ДНК
Идеальная интеграция с CRISPR/Cas9, по мнению авторов, должна позволять легко заменять участки гомологии на предварительно собранных донорных конструкциях с помощью упрощенной реакции сборки Golden Gate.
Команда использовала промышленные дрожжи Yarrowia lipolytica для создания набора инструментов, сочетающего стратегии редактирования генов и сборки ДНК для высокой эффективности и универсальности.
Модульная архитектура набора и инженерия метаболических путей
Ученые раскрыли полный потенциал CRISPR/Cas9, разработав набор инструментов на основе известных систем сборки Golden Gate. Они протестировали систему, создав несколько библиотек промоторов, выделенных из генов рибосомальных белков Y. lipolytica, и получили промоторы разной силы.
Чтобы продемонстрировать работу усовершенствованного метода CRISPR/Cas9, команда сконструировала штамм Y. lipolytica для производства гомогентизиновой кислоты (HGA). В щелочных условиях HGA спонтанно окисляется с образованием пиомеланина — ценного компонента натуральных солнцезащитных средств и косметики.
Для этого ученые:
- Выбрали гены-мишени (кодирующие ароматические аминотрансферазы).
- Отобрали три гена для сверхэкспрессии, чтобы усилить de novo синтез HGA.
- Изучили и инактивировали путь деградации HGA, о существовании которого в Y. lipolytica ранее не было известно.
Перспективы
Эта работа демонстрирует, насколько метаболическая инженерия зависит от эффективных методов манипуляции с ДНК. Ученые доказали функциональность платформы как для быстрого конструирования штаммов, так и для характеризации больших библиотек промоторов. Они ожидают, что этот набор инструментов найдет широкое применение в инженерии штаммов в промышленности, а разработанная для Y. lipolytica модель будет полезна и в других областях биологической инженерии.