Новый метод расщепления ДНК может расширить возможности генной инженерии

Традиционная генная инженерия растений, животных и микроорганизмов, таких как бактерии, часто использует рестрикционные ферменты для «вырезания и вставки» фрагментов ДНК в определённые участки генетической последовательности. Этот процесс ограничен специфическими сайтами узнавания, что сужает возможности конструирования рекомбинантных молекул ДНК.

Исследовательская группа под руководством Хироки Уэды из Лаборатории синтетической биологии Центра количественной биологии RIKEN разработала химический, неферментативный метод рекомбинации. Вместо ферментов он использует аналог основания ДНК — 5-этинилурацил — для расщепления цепи в любом сайте, содержащем нуклеотид тимин.

Метод, названный количественным расщеплением ДНК, индуцированным основанием (QBIC), включает несколько этапов:

1. Создание фрагментов ДНК, в которых тимин заменён на структурно схожий 5-этинилурацил.
2. Обработка этих фрагментов в водном растворе метиламина (производного аммиака). В этой химической ванне все нуклеотиды с 5-этинилурацилом расщепляются, образуя разрывы.
3. Образование «липких» (комплементарных) концов в местах разрывов, которые позволяют встраивать фрагменты в кольцевые молекулы ДНК — плазмиды.
4. Введение рекомбинантных плазмид в клетку-мишень (например, бактерию E. coli) для завершения генетической модификации.

Преимущества QBIC-метода:

• Свобода дизайна: «Мы можем свободно проектировать последовательности на выступающих терминалях, образующихся при расщеплении ДНК», — отмечает Кацухико Мацумото из исследовательской группы.
• Простота процедуры: Конкатенация (соединение) ДНК требует лишь добавления и удаления метиламина, гибридизации нагреванием/охлаждением и внедрения в организм.
• Устойчивость к условиям: Химический метод менее чувствителен к лабораторным условиям, чем ферментативный, и может проводиться при комнатной температуре.
• Экономичность: Как правило, он дешевле ферментных методов.

Текущее ограничение: в своей нынешней форме QBIC-метод может приводить к потере структуры длинных фрагментов ДНК после обработки метиламином, что препятствует восстановлению их двухцепочечной спиральной формы.

Команда Уэды работает над усовершенствованием протокола для работы с более длинными фрагментами ДНК. «Если мы найдём решение этой проблемы, — говорит Мацумото, — метод QBIC станет очень привлекательным для конкатенации длинных фрагментов ДНК».