Геномное редактирование CRISPR/HDR для расширения функций антител, продуцируемых гибридомами
Исследователи из Нидерландов создали универсальную платформу на основе системы CRISPR и репарации с направляемой гомологией (HDR) для быстрого редактирования доменов иммуноглобулинов. Это позволяет получать рекомбинантные гибридомы, секретирующие антитела заданного формата, вида или изотипа.
Проблема и решение
- Традиционные методы генной инженерии моноклональных антител (mAb) — секвенирование, клонирование в плазмиды, экспрессия — требуют много времени, сложны и дороги, что тормозит доклинические исследования.
- Новый подход использует одноэтапное редактирование генома CRISPR/HDR непосредственно в гибридомных клетках. Это позволяет быстро получать рекомбинантные гибридомы, секретирующие mAb с выбранным Fc-форматом, а также устанавливать нужные метки или мутации.
Ключевые результаты
С помощью платформы были успешно созданы гибридомы, продуцирующие:
- Моновалентные Fab'-фрагменты с C-концевыми метками для очистки и модификации.
- Химерные антитела с изотипом и видоспецифичностью по выбору.
- Fc-мутантные антитела без эффекторных функций.
Инженерные антитела сохранили исходную антигенную специфичность. Их продукция гибридомами не снижалась в течение 1–3 лет.
Валидация метода
- In vitro: Анализ методом вестерн-блоттинга подтвердил замену нативной тяжелой цепи крысы на введенную генетически тяжелую цепь мыши на белковом уровне.
- Функциональные тесты: Измерения взаимодействия "антитело-рецептор" и тесты in vitro/in vivo на способность индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и истощать B-клетки показали, что химерные и мутантные mAb, созданные с помощью CRISPR/HDR, обладают такими же биохимическими и иммунологическими характеристиками, как их нативные и рекомбинантные аналоги.
Значение и перспективы
- Универсальность и эффективность: Платформа имеет 100% успешность — каждый эксперимент по геномному редактированию с одним HDR-конструктом давал несколько правильно модифицированных клонов гибридом. Метод применим к гибридомам любого вида или изотипа.
- Ускорение исследований: Процесс получения желаемых гибридом занимает до 21 дня и доступен любой лаборатории, способной культивировать клеточные линии гибридом.
- Применения: Технология позволяет реконструировать существующие библиотеки гибридомных линий и найдет широкое применение в биомедицинской инженерии, химической биологии, разработке лекарств и наномедицине, способствуя доклиническим исследованиям антител.
Исследование опубликовано в журнале Science Advances.