Преодоление препятствий в редактировании генов CRISPR для улучшения лечения

Ученые все чаще используют мощный новый инструмент редактирования генов CRISPR/Cas9, технологию, выделенную из бактерий, которая обещает новые методы лечения таких генетических заболеваний, как муковисцидоз, мышечная дистрофия и гемофилия. Однако для эффективной работы инструмент должен быть безопасно доставлен через клеточную мембрану в ядро. Этот сложный процесс может активировать защитные механизмы клетки и «захватить» CRISPR/Cas9, значительно снижая его терапевтический потенциал.

Исследователи из лаборатории нанохимика Винсента Ротелло в Массачусетском университете в Амхерсте разработали систему доставки с использованием наночастиц. Она помогает CRISPR/Cas9 преодолеть мембрану и попасть в ядро клетки, избегая захвата клеточными механизмами. Подробности опубликованы в журнале ACS Nano.

Рубул Моут, руководитель эксперимента, поясняет: «CRISPR состоит из двух компонентов: белка Cas9, похожего на ножницы, и молекулы РНК (sgRNA), которая направляет Cas9 к целевому гену. Попав в ядро, комплекс Cas9-sgRNA может находить генетические ошибки и исправлять их с помощью репарационных механизмов клетки-хозяина».

С момента открытия потенциала CRISPR в 2012 году редактирование генов быстро стало интенсивной темой исследований в биологии и медицине. Цель — лечить неизлечимые генетические заболевания путем манипуляции с поврежденными генами. «Однако для этого биотехнологические и фармацевтические компании постоянно ищут более эффективные методы доставки CRISPR», — добавляет Моут.

Новый метод доставки, разработанный Ротелло, Моутом и коллегами, включает модификацию белка Cas9 (Cas9En) и наночастиц-носителей. Ротелло объясняет: «Тонко настраивая взаимодействие между модифицированным белком Cas9En и наночастицами, мы создали эти векторы доставки. Векторы, несущие белок Cas9 и sgRNA, контактируют с клеточной мембраной, сливаются с ней и высвобождают комплекс Cas9:sgRNA прямо в цитоплазму клетки».

«Белок Cas9 также имеет ядерную сигнальную последовательность, которая направляет комплекс в ядро. Ключ — в модификации белка Cas9», — добавляет он. «Мы доставили эту пару в ядро, не позволив ей быть захваченной по пути, и наблюдали за процессом в реальном времени с помощью сложной микроскопии».

По словам Моута и коллег, им удалось доставить комплекс белка Cas9 и sgRNA примерно в 90% клеток, выращенных в культуре, с эффективностью редактирования около 30%. «Доставка в 90% клеток — это огромный прогресс по сравнению с другими методами», — отмечает Моут.

Исследователи полагают, что Cas9En может стать платформой для доставки и других материалов, таких как полимеры, липидные наночастицы или самособирающиеся пептиды. Ротелло говорит: «Достигнув эффективного редактирования генов в культуре клеток, мы нацелены на редактирование в доклинических моделях на животных. Нас также интересует редактирование генов для адиктивной терапии, когда больная клетка изолируется от пациента, корректируется CRISPR в лаборатории и возвращается пациенту».

Помимо редактирования генов, новый метод доставки может иметь и другие применения. Например, для отслеживания ДНК и РНК внутри клеток. Мумита Рэй, другой исследователь из лаборатории Ротелло, говорит: «Наш метод позволяет точно отслеживать перемещение белка Cas9 внутри клетки, открывая новые возможности в геномных исследованиях».