Учёные раскрыли механизмы эффективности CRISPR для редактирования генов
CRISPR/Cas9 — это инструмент для редактирования генов, который произвёл революцию в биомедицинских исследованиях и привёл к появлению первой одобренной FDA CRISPR-терапии. Однако до сих пор точный механизм его работы и избегания вредных побочных эффектов (off-target) не был до конца понятен.
Используя передовые технологии, исследователи из Детской больницы Филадельфии (CHOP) определили несколько конкретных этапов, необходимых для активации CRISPR и выполнения его функции редактирования генов. Эти доклинические результаты могут привести к улучшению дизайна CRISPR-систем. Результаты опубликованы в журнале Cell Chemical Biology.
Редактирование генов позволяет добавлять, удалять или иным образом изменять генетический материал в геноме человека. В здравоохранении оно имеет огромный потенциал для «исправления» мутировавших генов, лежащих в основе многих редких и сложных заболеваний. Однако для эффективности редактирование должно быть точным и воздействовать только на заданную мишень.
Хотя с 2020 года в клинических испытаниях изучается прямая доставка Cas9 пациентам через липидные наночастицы, широкое применение этого метода затруднено. Cas9 может производить непреднамеренные изменения генома вне целевого гена, что может быть вредным и даже превращать клетки в раковые.
Поэтому для редактирования генов вне организма обычно используются клетки, взятые у пациента, которые затем возвращаются обратно. Это дорогой и длительный процесс, обусловленный неполным пониманием механизмов редактирования.
«Мы всегда подозревали, что существующие структуры, которые мы видим в процессе редактирования генов, не рассказывают нам всей истории», — сказал старший автор исследования Николаос Г. Сгуракис, доктор философии.
В этом исследовании учёные использовали метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), чтобы визуализировать атомы и белки, а также их динамику, и наблюдать, как они переходят между разными состояниями. Этот метод позволил наблюдать, как CRISPR переходит из неактивного состояния в активное, и какие шаги для этого требуются.
Как корректор на сборочной линии, промежуточная «контрольная» структура служит привратником, регулирующим активность фермента по разрезанию ДНК. Этот шаг является ключевым для различения целевых и нецелевых последовательностей ДНК белком Cas9, который сопоставляет их с программируемой направляющей РНК (guide RNA).
Существует множество инженерных вариантов Cas9. Варианты с высокой точностью (higher fidelity) способствуют распознаванию целевой ДНК и помогают стабилизировать «контрольный» комплекс, тем самым снижая побочные эффекты и обеспечивая более точную доставку терапии.
Понимание этих базовых механизмов работы CRISPR и Cas9 может привести к созданию более эффективных форм технологии редактирования генов, включая возможность прямой доставки терапии в организм, и даже улучшить другие методы лечения, такие как CAR-T-клеточная терапия.
«Гораздо проще доставить заранее запрограммированный комплекс Cas9 в форме липидной наночастицы для прямого редактирования целевых клеток пациента, когда мы можем быть уверены, что он выполнит свою работу правильно», — сказал Сгуракис. — «Например, точное редактирование генов с помощью технологии CRISPR можно использовать для прямой модификации Т-клеток у пациентов, что позволит упростить адаптацию CAR-T и других клеточных терапий».
ЯМР-спектроскопия для этого исследования проводилась в Институте структурной биологии Пенсильванского университета с использованием общего оборудования Медицинской школы Перельмана при Пенсильванском университете и CHOP.