Открытие предлагает отправную точку для лучших инструментов редактирования генов

CRISPR открыл эру геномной медицины. На основе популярного CRISPR-Cas9 был создан ряд мощных инструментов для лечения генетических заболеваний. Однако существует проблема «последней мили» — эти инструменты необходимо эффективно доставить в каждую клетку пациента, и большинство белков Cas9 слишком велики, чтобы поместиться в популярные векторы для генной терапии, такие как аденоассоциированный вирус (AAV).

В новом исследовании учёные из Корнеллского университета объясняют, как эта проблема решается в природе: они с атомарной точностью определили, как система, производная от транспозона, редактирует ДНК с помощью РНК-гида. Транспозоны — это мобильные генетические элементы внутри бактерий. Одна из линий транспозонов кодирует белок IscB, который более чем в два раза меньше Cas9, но столь же способен к редактированию ДНК. Замена Cas9 на IscB окончательно решила бы проблему размера.

Исследование «Structural Basis for RNA-Guided DNA Cleavage by IscB-ωRNA and Mechanistic Comparison with Cas9» было опубликовано 26 мая в журнале Science.

Исследователи использовали криоэлектронную микроскопию (Cryo-EM), чтобы визуализировать молекулу IscB-ωRNA из системы транспозона с высоким разрешением. Им удалось получить снимки системы в разных конформационных состояниях. Они даже смогли создать более компактные варианты IscB, удалив из белка несущественные части.

«Следующее поколение сложных приложений требует слияния генного редактора с другими ферментами и активностями, а большинство Cas9 уже слишком велики для вирусной доставки. Мы сталкиваемся с пробкой на этапе доставки», — сказал автор-корреспондент Айлонг Ке, профессор молекулярной биологии и генетики. — «Если Cas9 можно упаковать в вирусные векторы, которые десятилетиями используются в области генной терапии, такие как AAV, то мы можем быть уверены в их доставке и сосредоточить исследования исключительно на эффективности самого инструмента редактирования».

Системы CRISPR-Cas9 используют РНК в качестве гида для распознавания последовательности ДНК. Когда совпадение найдено, белок Cas9 разрезает целевую ДНК в нужном месте; затем становится возможной «хирургия» на уровне ДНК для лечения генетических заболеваний. Данные Cryo-EM, собранные командой из Корнелла, показывают, что система IscB-ωRNA работает аналогичным образом, а её меньший размер достигается за счёт замены частей белка Cas9 на структурированную РНК (ωRNA), которая соединена с гидовой РНК. Заменяя белковые компоненты более крупного Cas9 на РНК, белок IscB уменьшается до ядра химических реакционных центров, разрезающих целевую ДНК.

«Речь идёт о понимании структуры молекул и того, как они осуществляют химические реакции», — сказал первый автор Габриэль Шулер, аспирант в области микробиологии. — «Изучение этих транспозонов даёт нам новую отправную точку для создания более мощных и доступных инструментов редактирования генов».

Считается, что транспозоны — мобильные генетические элементы — были эволюционными предшественниками систем CRISPR. Их открыла лауреат Нобелевской премии Барбара Мак-Клинток.

«Транспозоны — это специализированные генетические автостопщики, постоянно встраивающиеся в наши геномы и вырезающиеся из них», — сказал Ке. — «Системы внутри бактерий, в частности, постоянно подвергаются отбору — природа, по сути, бросила кости миллиарды раз и создала действительно мощные инструменты для хирургии ДНК, включая CRISPR. И теперь, определяя эти ферменты с высоким разрешением, мы можем использовать их возможности».

Хотя IscB намного меньше CRISPR-Cas9, исследователи полагают, что смогут сделать его ещё меньше. Они уже удалили 55 аминокислот, не повлияв на активность IscB; они надеются сделать будущие версии этого геномного редактора ещё компактнее и, следовательно, ещё полезнее.

Лучшее понимание функции гидовой РНК было ещё одной мотивацией для исследования, сказал соавтор Чуньи Ху, постдокторант. «Остаётся ещё много загадок — например, почему транспозоны используют РНК-направляемую систему? Какие ещё роли может играть эта РНК?»

Одной из оставшихся проблем является то, что, хотя IscB-ωRNA чрезвычайно активен в пробирке (in vitro), он не так эффективен для изменения ДНК в клетках человека. Следующим шагом в их исследовании будет использование молекулярной структуры для изучения возможных причин низкой активности в клетках человека. «У нас есть некоторые идеи, их даже много, которые мы с нетерпением хотим проверить в ближайшем будущем», — сказал Шулер.