Улучшение технологии CRISPR-Cas9 повышает эффективность «вырезания и вставки» ДНК

Исследователи из Калифорнийского университета в Беркли добились значительного улучшения технологии CRISPR-Cas9, достигнув беспрецедентного уровня успеха в 60% при замене короткого участка ДНК на другой.

Усовершенствованная методика особенно полезна для исправления генетических мутаций, вызывающих наследственные заболевания, такие как серповидноклеточная анемия или тяжелый комбинированный иммунодефицит. Технология позволяет «залатать» аномальный участок ДНК нормальной последовательностью и потенциально исправить дефект. Она уже успешно работает в культуре клеток, улучшая текущие усилия по репарации дефектных генов.

«Захватывающая особенность CRISPR-Cas9 — это перспектива исправления генов непосредственно в нашем геноме, но эффективность этого процесса может быть очень низкой», — сказал Джейкоб Корн, научный директор Инициативы инновационной геномики (IGI) в UC Berkeley. — «Если представить редактирование генов как текстовый процессор, мы знаем, как вырезать, но нам нужен более эффективный способ вставить и склеить новый фрагмент ДНК в месте разреза».

«В случаях, когда нужно изменить очень маленькие участки ДНК, до 30 пар оснований, эта техника будет чрезвычайно эффективна», — отметил первый автор исследования Кристофер Ричардсон, постдок в IGI.

Проблемы в коротких участках ДНК, включая мутации в одной паре оснований, типичны для многих генетических заболеваний. Пары оснований — это отдельные строительные блоки ДНК, соединенные в цепь, которая скручивается вокруг комплементарной цепи, образуя известную двойную спираль молекулы ДНК.

Ричардсон, Корн и их коллеги из IGI описывают новую технику в выпуске журнала Nature Biotechnology от 21 января.

Захват свободного конца

Ричардсон разработал новый подход, обнаружив, что белок Cas9, который осуществляет фактическое разрезание ДНК, остается прикрепленным к хромосоме до шести часов, долгое время после того, как разрезал двуцепочечную ДНК. Изучив комплекс белка Cas9, связанного с двумя цепями ДНК, он обнаружил, что белок удерживает три из четырех концов разреза, в то время как один конец остается свободным.

Когда Cas9 разрезает ДНК, репарационные системы клетки могут использовать комплементарную ДНК, называемую матрицей, для починки разреза. Исследователи могут добавлять матрицы, содержащие изменения для модификации существующих последовательностей в геноме, например, для коррекции вызывающей болезнь мутации.

Ричардсон предположил, что доставка замещающей матрицы непосредственно к месту разреза повысит эффективность «заплатки». Он сконструировал фрагмент ДНК, который соответствует свободному концу ДНК и несет на другом конце генетическую последовательность для вставки. Методика сработала исключительно хорошо, позволив успешно исправить мутацию с эффективностью до 60%.

«Наши данные указывают, что разрывы, создаваемые Cas9, могут отличаться на молекулярном уровне от разрывов, генерируемых другими целевыми нуклеазами, такими как TALEN и цинковые пальцы. Это говорит о том, что стратегии, подобные нашей, могут обеспечить более эффективный ремонт разрывов от Cas9», — сказал Ричардсон.

Исследователи также показали, что варианты белка Cas9, которые связывают ДНК, но не разрезают ее, также могут успешно «вклеить» новую последовательность ДНК в сайт связывания, возможно, за счет образования «пузырьковой» структуры на целевой ДНК, которая также привлекает матрицу для репарации. Редактирование генов с использованием Cas9 без разрезания генома может быть безопаснее обычного, поскольку устраняет опасность нецелевого разрезания в геноме, отметил Корн.