CRISPR-технология позволит раньше диагностировать губительную болезнь цитрусовых

Ученые из Университета штата Пенсильвания и Министерства сельского хозяйства США использовали передовую технологию CRISPR/Cas для разработки диагностического теста, который может обеспечить раннюю диагностику позеленения цитрусовых (Huanglongbing, HLB). Эта серьезная болезнь угрожает мировому производству цитрусовых, стоимость которого оценивается примерно в $17 млрд от продажи свежих фруктов и соков.

В исследовании, опубликованном в журнале Phytopathology, ученые показали, что новый анализ может обнаруживать возбудителя болезни — бактерию Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) — с чувствительностью в 100–1000 раз выше, чем широко используемый диагностический тест количественной полимеразной цепной реакции (qPCR).

Болезнь, впервые описанная в Азии более века назад, достигла Флориды в 2005 году. С тех пор она уничтожила более 70% урожая апельсинов в этом штате. Патоген также распространился в Техас, Калифорнию, Джорджию и Луизиану, угрожая индустрии цитрусовых США стоимостью $3,35 млрд.

Распространяемая насекомым-переносчиком (азиатской цитрусовой листоблошкой) или прививкой зараженных тканей, бактерия CLas не опасна для людей или животных. Однако для зараженного дерева болезнь неизлечима. По данным USDA, у инфицированных деревьев наблюдается асимметричное пожелтение листьев и жилок («мраморность»), а плоды становятся зелеными, деформированными и горькими. Большинство зараженных деревьев погибает через несколько лет.

Ученые считают, что лучшая надежда сдержать распространение болезни — быстрое удаление больных деревьев. Поэтому раннее обнаружение патогена критически важно, так как зараженные деревья могут служить резервуаром болезни в течение месяцев или лет до появления видимых симптомов.

Для решения этой задачи исследователи применили CRISPR/Cas — мощную технологию редактирования генов, недавно адаптированную для молекулярной диагностики.

«Различные технологии, такие как детекция с помощью собак и qPCR, уже используются для диагностики CLas, — отметил соавтор исследования Инонг Ян. — Но эти инструменты часто недостаточны для раннего обнаружения CLas в бессимптомной ткани, где присутствует мало бактерий, и непригодны для высокопроизводительной диагностики в полевых условиях».

Исследователи адаптировали систему CRISPR/Cas для разработки анализа на платформе DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter). В этом анализе вариант фермента Cas12a смешивается с CRISPR РНК, нацеленной на поиск ДНК CLas, и синтетической молекулой-репортером. Если ДНК CLas присутствует, Cas12a расщепляет как ДНК патогена, так и репортер, что приводит к генерации флуоресцентного сигнала для детекции.

Ученые сообщают, что анализ был высокочувствительным и специфичным для обнаружения ДНК CLas. Для считывания результата можно использовать либо микропланшетный ридер (флуоресценция), либо латеральную тест-полоску для визуального результата (по аналогии с домашним тестом на беременность).

«Анализ успешно обнаружил и подтвердил наличие нуклеиновых кислот CLas в зараженных образцах, собранных во Флориде, — сказал ведущий автор исследования Мэтью Уитли. — Мы протестировали ДНК из зараженных сладкого апельсина, помело, грейпфрута, барвинка и цитрусовой листоблошки, а также из незараженных образцов в качестве отрицательного контроля. Анализ CLas DETECTR подтвердил, что все зараженные образцы были положительными. Интересно, что два образца ДНК грейпфрута, которые ранее дали отрицательный результат по qPCR, показали слабую положительную реакцию в анализе DETECTR».

Инонг Ян отметил, что совместимость анализа DETECTR с технологией латерального потока открывает перспективы для быстрого и экономичного тестирования на HLB в полевых условиях.

«Эти результаты показывают, что стратегии обнаружения на основе CRISPR/Cas способны улучшить текущую диагностику позеленения цитрусовых, обеспечивая специфичное и высокочувствительное обнаружение нуклеиновых кислот CLas. Улучшенная чувствительность обнаружения и простота использования по сравнению с традиционными методами, такими как qPCR, делают анализ CLas DETECTR перспективным инструментом для диагностики HLB в регионах, где встречается патоген CLas».