Первые изображения «усовершенствованного» инструмента CRISPR

Ученые из Колумбийского университета получили первые изображения нового инструмента для редактирования генов, который может превзойти существующие инструменты на основе CRISPR. Инструмент, названный INTEGRATE, был разработан после открытия уникального «прыгающего гена» в бактериях Vibrio cholerae, способного встраивать большие генетические конструкции в геном без разрывов ДНК.

В новом исследовании, опубликованном в Nature, исследователи использовали удостоенную Нобелевской премии технику криоэлектронной микроскопии, чтобы «заморозить» комплекс для редактирования генов в действии и раскрыть детали его работы с высоким разрешением.

«Мы показали в нашем первом исследовании, как использовать INTEGRATE для целевых вставок ДНК в бактериальные клетки. Эти новые изображения объясняют биологию с невероятной молекулярной детализацией и помогут нам улучшить систему, направляя усилия по белковой инженерии», — говорит Сэм Стернберг, руководивший исследованием.

Начинается как CRISPR, но заканчивается иначе

Исследователи использовали криоэлектронную микроскопию: комплекс для редактирования генов быстро замораживали в жидком азоте и бомбардировали электронами. На основе полученных изображений были созданы атомные модели системы INTEGRATE.

Структурная модель показывает, что комплекс состоит из двух основных частей, расположенных в виде спиральной нити. Большая часть, называемая Cascade, обвивается вокруг направляющей РНК, которую она использует для поиска в клетке соответствующей последовательности в ДНК. Обнаружив и связавшись с целевой последовательностью, она пропускает цепь ДНК через белки «транспозиции» TniQ, которые находятся на конце комплекса и рекрутируют другие ферменты для модификации ДНК.

Механизм поиска INTEGRATE работает аналогично другим хорошо изученным системам CRISPR, некоторые из которых также содержат комплекс Cascade с направляющей РНК. Однако, в отличие от систем CRISPR, использующих Cascade для разрезания ДНК, функция Cascade в INTEGRATE — нацеливание на ДНК для высокоточного встраивания генетических конструкций.

Почему это важно

CRISPR-Cas9 широко используется для быстрого и точного редактирования генома клетки. Однако большинство применений CRISPR связано с разрезанием обеих цепей целевой ДНК, и разрыв затем должен быть восстановлен собственными механизмами клетки-хозяина. Контроль над этим процессом восстановления остается серьезной проблемой, и в геном часто непреднамеренно вносятся нежелательные изменения. Кроме того, существующие инструменты часто плохо справляются с точным встраиванием больших генетических конструкций.

Новая система INTEGRATE, разработанная в лаборатории Стернберга, может точно вставлять большие последовательности ДНК, не полагаясь на механизмы восстановления клетки. В результате INTEGRATE может оказаться более точным и эффективным способом внесения определенных генетических модификаций, чем широко используемая исходная система CRISPR-Cas. Новый инструмент также может помочь ученым проводить редактирование генов в типах клеток с ограниченной активностью восстановления ДНК, например, в нейронах.

Что дальше

Структуры также выявили возможную контрольную точку «корректуры». Существующие технологии CRISPR часто страдают от «внецелевых эффектов», когда модифицируются непреднамеренные последовательности. Новые структуры показывают, как Cascade и TniQ работают вместе, чтобы гарантировать, что только правильные «целевые» последовательности помечаются для вставки ДНК. Исследователи планируют изучить эту контрольную точку, одновременно разрабатывая инструмент для новых терапевтических подходов к лечению заболеваний.

Статья «Structural basis of DNA targeting by a transposon-encoded CRISPR-Cas system» была опубликована онлайн 18 декабря в журнале Nature.