Новый инструментарий позволяет редактировать геномы без CRISPR

Исследователи из VIB-KULeuven Center for Microbiology и VIB-UGent Center for Plant Systems Biology разработали новый инструментарий из 16 различных коротких последовательностей ДНК, которые позволяют запускать контролируемые и специфичные рекомбинации в любом геноме.

Этот новый запатентованный инструментарий, дополняющий — а для некоторых применений превосходящий — CRISPR, теперь доступен для исследователей и индустрии в области геномной инженерии. Результаты опубликованы в двух статьях в Nature Communications.

Сайт-специфичные рекомбиназы обеспечивают эффективное вырезание и вставку ДНК в определённых участках генома, где каждая рекомбиназа распознаёт одну точную последовательность ДНК. Из-за своей специфичности к последовательности, системы CRISPR в последнее десятилетие затмили сайт-специфичные рекомбиназы как инструмент геномной инженерии.

Системы CRISPR произвели революцию в области, поскольку их можно легко нацелить на различные геномные локусы. Однако, поскольку сайт-специфичные рекомбиназы работают иначе, они обходят некоторые основные проблемы CRISPR, включая токсичность двухцепочечных разрывов ДНК, вызывающую нежелательные точечные мутации и структурные вариации, низкую эффективность редактирования во многих нетрадиционных организмах и неделящихся клетках, а также сложность вставки крупных фрагментов ДНК. Кроме того, сложная патентная ситуация с CRISPR часто делает его использование в исследованиях и промышленности трудным и дорогим.

Исследовательские группы VIB-KULeuven Center for Microbiology и их коллеги из VIB-UGent Center for Plant Systems Biology устранили недостатки ранних систем сайт-специфичной рекомбинации как средства геномной инженерии. Команда расширила инструментарий, использующий вирусную рекомбиназу (Cre), так что теперь она может специфически распознавать, вырезать и вставлять несколько сайтов ДНК. Команда идентифицировала набор из 16 сайтов, которые эффективно рекомбинируют с тем же сайтом, но не с любым другим сайтом этого набора, и это работает для разных организмов.

"Благодаря этим ортогональным системам рекомбинации мы можем избежать непредсказуемого взаимодействия множественных сайтов рекомбинации в геноме друг с другом", — говорит Кевин Верстрепен, директор VIB-KULeuven Center for Microbiology. "Это открывает возможности для многих исследовательских проектов по одновременному внесению множества небольших или крупных геномных правок или многократной переустановке маркеров в ходе работ по геномной инженерии".

Применения для исследований и промышленности

Шарлотт Котерлис, аспирант лаборатории Кевина Верстрепена, внедрила новый инструментарий в дрожжах и протестировала его в бактериальных клетках. Затем она сотрудничала с центром VIB-UGent PSB, чтобы также продемонстрировать его эффективность в растительных клетках.

В своей последней публикации она показывает, как его можно использовать для оптимизации экспрессии генов метаболических путей и титров производства промышленно значимых молекул. Один раунд перетасовки регуляторов генов с помощью новых сайтов рекомбинации уже удвоил титры производства.

"Мы смогли подтвердить, что модификация экспрессии с помощью нашей системы на основе рекомбинации позволяет быстро и эффективно оптимизировать экспрессию генов в гетерологичных биосинтетических путях", — говорит Котерлис. "Этот новый инструментарий не только предлагает возможности для улучшения микробных клеточных фабрик, но и подтверждает его ценность для учёных и промышленности, работающих в области геномной инженерии".