Cpf1 в CRISPR-редактировании генома: высокая специфичность и создание мутантных мышей

Новый инструмент CRISPR-редактирования генома, Cpf1, привлекает внимание благодаря своим отличиям от Cas9: ему требуется только одна РНК, он создает ступенчатые разрезы ДНК и распознает богатые тимином последовательности. Это расширяет спектр мишеней для редактирования.

В двух статьях в Nature Biotechnology исследователи из Центра редактирования генома IBS (Южная Корея) продемонстрировали высокую специфичность Cpf1 и создали мутантных мышей с его помощью.

Высокая специфичность Cpf1

Исследователи использовали белки семейства Cpf1 (AsCpf1 и LbCpf1) и метод Digenome-seq для анализа сайтов разреза в геноме человека.

• Результаты: Cpf1 показал высокую специфичность. Было обнаружено значительно меньше нецелевых сайтов разреза (6 для LbCpf1 и 12 для AsCpf1) по сравнению с Cas9 (>90 сайтов).
• На большинстве нецелевых сайтов in vitro уровень инделов (представляющих побочные эффекты) был ниже 0.1%, что указывает на практически полное отсутствие нецелевых эффектов.
• Для снижения побочных эффектов в клетки вводили преассемблированные Cpf1 RNP-комплексы. Они быстро расщепляют мишень и деградируют, что минимизирует нецелевые мутации.

Создание мутантных мышей

Другая команда центра успешно применила Cpf1 RNP для редактирования эмбрионов мышей.

• Мишени: Гены Foxn1 (регулятор иммунной системы и роста волос) и Tyrosinase (фермент синтеза меланина).
• Эффективность: Частота мутаций составила 64% и 33% соответственно. После трансплантации эмбрионов суррогатным матерям были получены мыши с целевыми мутациями: безволосая и беловолосая.
• Анализ специфичности: Полногеномное секвенирование и таргетное глубокое секвенирование мутантных мышей не выявили нецелевых мутаций.
• Метод доставки: Для одновременного введения Cpf1 RNP в до 50 эмбрионов использовали электропорацию. Этот метод оказался проще, быстрее и масштабируемее, чем традиционная микроинъекция.

Перспективы

По словам директора центра KIM Jin-Soo, доказанная высокая специфичность Cpf1 открывает широкие возможности для точного редактирования генома без нежелательных мутаций. Применения могут варьироваться от терапевтических методов (например, нетоксичные противораковые препараты, лечение стволовыми клетками) до создания высококачественных сельскохозяйственных продуктов и животных.