Новый метод визуализации синтеза коллагена в живых клетках в реальном времени

Коллаген — критически важный белок, формирующий основу для кожи, мышц, костей и других органов. Однако оставались пробелы в понимании того, как фибробласты синтезируют его волокна.

Группа исследователей под руководством доцента Тосиаки Танаки из Токийского технологического института разработала систему визуализации в реальном времени для наблюдения за обработкой проколлагена I типа внутри клеток.

Метод: маркировка без нарушения структуры

Команда «вставила флуоресцентные белковые метки в пре-проколлаген I типа α1». Ранее такая маркировка молекул проколлагена (которые образуются внутри фибробластов и затем превращаются в коллаген) не применялась, так как она нарушала тонкую структуру коллагена. В статье, опубликованной в Life Science Alliance (18 февраля 2022 г. онлайн, май 2022 г., том 5, выпуск 5), исследователи сообщили, что смогли идентифицировать области для вставки меток, не нарушающие стабильность структуры коллагена. Помеченный проколлаген ввели в фибробласты и изучили в реальном времени с помощью конфокальной микроскопии, иммуноокрашивания и коллагеновых анализов.

Ключевое открытие: внутриклеточное расщепление

Доктор Танака сообщает о результатах: «Считается, что фибробласты секретируют предшественник коллагена, состоящий из коллагена, N-пропептида (N-pp) и C-пропептида (C-pp). Внеклеточно N-pp и C-pp затем расщепляются ферментами пептидазами, и образуется коллаген. Но мы обнаружили, что эти пропептиды расщепляются внутри фибробласта».

Исследования в реальном времени показали, что после расщепления N-pp транспортировался за пределы клетки, а C-pp накапливался вокруг ядра клетки, где подвергался дальнейшей обработке и деградации, прежде чем небольшая его часть секретировалась наружу.

Применение: изучение фиброза печени

Внутриклеточная обработка, транспорт и секреция коллагена были определены как самый медленный этап его синтеза. Мониторинг этого этапа позволяет эффективно обнаруживать относительные изменения в секреции коллагена.

Команда применила метод для изучения фиброза печени — заболевания, возникающего из-за дисбаланса секреции коллагена и других белков звездчатыми клетками печени (HSCs). Этот дисбаланс приводит к образованию рубцовой ткани.

«При фиброзе печени HSCs активируются и начинают секретировать аномально толстые и длинные коллагеновые фибриллы. В наших экспериментах мы наблюдали, что производство таких волокон связано с дефектной внутриклеточной обработкой проколлагена», — говорит доктор Танака.

В будущем метод может помочь в разработке молекул и терапий для регуляции производства коллагена и лечения заболеваний, связанных с нарушением его синтеза, таких как фиброз печени.