Новый метод освещает «тёмную сторону» транскриптома
Исследователи из Медицинской школы Перельмана Пенсильванского университета разработали новый метод картирования «транскриптома» — совокупности молекул РНК, которые экспрессируются активными генами клетки. РНК является как молекулярным мостом между ДНК и производством белков, так и молекулярным инструментарием, помогающим этим белкам выполнять свои функции. РНК существует в различных формах, и не все они до конца изучены.
Применяя новый метод, команда идентифицировала варианты РНК у млекопитающих, которые были практически невидимы для предыдущих технологий. Исследователи также показали, что эти «тёмные» вариации РНК поразительно распространены в клетках млекопитающих и, вероятно, играют роль в регуляции генов в различных тканях, в процессе развития и при человеческих заболеваниях. Команда планирует использовать новое бесплатное программное обеспечение для анализа аномальных клеток при нейродегенеративных расстройствах, раке и других болезнях.
«Это очень интересно... потому что теперь мы можем вернуться к огромному массиву существующих данных транскриптома, зная, что появятся новые и важные вещи», — сказал старший автор работы Йосеф Бараш, PhD.
Отчёт команды Бараша, включавшей соавторов Хорхе Вакеро-Гарсию, Алехандро Барреру и Мэтью Р. Гадзарру, был опубликован на этой неделе в онлайн-журнале eLife.
Неполная картина
Лаборатория Бараша занимается изучением транскриптов РНК и их вариаций с помощью машинного обучения и вычислительного моделирования. Один из основных механизмов вариативности — альтернативный сплайсинг — известен учёным с 1970-х годов. Когда кодирующий белок ген транскрибируется в РНК, клеточные механизмы разрезают свежий транскрипт на сегменты, удаляют некодирующие участки (интроны) и сшивают кодирующие участки (экзоны) в готовую матричную РНК (мРНК), которая затем транслируется в белок.
Иногда сплайсинговый аппарат намеренно пропускает один или несколько экзонов, что приводит к образованию более короткой мРНК, кодирующей другую форму белка. Таким образом, один ген может кодировать несколько форм одного белка, каждая из которых имеет свою биологическую роль. Известно, что отклонения от нормальных паттернов сплайсинга способствуют развитию многих заболеваний.
Долгосрочной проблемой для биологов было отсутствие лёгкого и безошибочного способа идентифицировать и количественно оценить все различные сплайс-варианты мРНК в образце. Современная технология секвенирования РНК (RNA-seq) даёт в основном последовательности лишь фрагментов мРНК. Эти фрагменты необходимо «сшить» обратно с помощью сложного программного обеспечения и существующих баз данных РНК, чтобы получить полную картину транскриптома. Но эта картина не обязательно является полной.
Новый взгляд на транскриптом
Новый подход команды Бараша начинается с картирования того, что они называют локальными вариациями сплайсинга (LSV) — по сути, вариабельных соединений между экзонами.
Команда разработала программное обеспечение MAJIQ (Modeling Alternative Junction Inclusion Quantification) для построения карт LSV на основе данных RNA-seq и их сочетания с существующими базами данных РНК. Это позволяет увидеть как обычные, известные сплайс-варианты, так и сложные варианты, которые другие методы не обнаруживают.
Чтобы оценить важность ранее невидимой части транскриптома, команда использовала MAJIQ для анализа данных RNA-seq различных видов, включая ящериц, мышей и людей. Анализ показал, что сложные сплайс-варианты встречаются гораздо чаще, чем считалось ранее, — составляя, например, около 37% вариаций транскриптома в образцах человека.
«Эти вариации немного похожи на тёмную сторону Луны... теперь выясняется, что они составляют треть вариаций в человеческих мРНК», — сказал Бараш.
Среди сложных вариантов сплайсинга, обнаруженных с помощью MAJIQ, оказался высококонсервативный, но ранее не описанный вариант гена Ptbp1, критически важного для правильного развития мозга. Дальнейший анализ показал, что вновь обнаруженный вариант участвует в контроле экспрессии Ptbp1 после рождения, вводя «ядовитый экзон», который помечает транскрипт для последующей деградации.
Другой сложный вариант, обнаруженный с помощью MAJIQ в человеческом синапс-связанном гене CAMK2D, экспрессировался примерно на 40% меньше в ткани мозга пациентов с болезнью Альцгеймера по сравнению с контрольной группой. Позже команда обнаружила аналогичное снижение во втором, более крупном наборе данных RNA-seq также от случаев болезни Альцгеймера. В целом команда идентифицировала около 200 случаев изменённого сплайсинга у пациентов с Альцгеймером, которые воспроизводились в двух независимых исследованиях.
«Мы думаем, что такие находки — лишь верхушка айсберга», — сказал Бараш. Он и его коллеги планируют продолжить исследования сложных сплайс-вариантов при других заболеваниях на основе MAJIQ. Пакет программного обеспечения MAJIQ теперь будет бесплатно доступен для других академических исследователей. Кроме того, команда создала дополнительный программный пакет VOILA, который позволяет исследователям визуализировать сложные сплайс-варианты, обнаруженные MAJIQ.