Исследователи создали молекулярные биосенсоры, которые светятся только при связывании с мишенью
Биосенсоры — устройства, использующие биологические молекулы для обнаружения целевых веществ — обладают огромным потенциалом для выявления биомаркеров болезней, молекул в действии или токсинов в окружающей среде.
Обычные флуоресцентные биосенсоры имеют низкую контрастность, так как их флуоресцентные зонды всегда «включены». Прорывом стали высококонтрастные «активируемые связыванием флуоресцентные биосенсоры» (нанозонды), которые светятся только при связывании с мишенью. Однако их создание сложно, так как необходимо совместить эффективное связывание и флуоресцентный «включатель» в небольшой молекуле, которую можно доставлять в образцы и производить в масштабе.
Совместная исследовательская группа из Института Висса при Гарвардском университете, Гарвардской медицинской школы (HMS), MIT и Эдинбургского университета (Великобритания) разработала платформу синтетической биологии для упрощения открытия, молекулярной эволюции и рентабельного производства небольших и высокоэффективных нанозондов. Они могут обнаруживать специфические белки, пептиды и малые молекулы, увеличивая свою флуоресценцию до 100 раз менее чем за секунду.
Ключевой компонент платформы
В качестве ключевого компонента платформа использует новые флуорогенные аминокислоты (FgAAs), которые можно встроить в целесвязывающие белковые последовательности (биндеры) с помощью инновационной методологии, позволяющей расширить генетический код in vitro.
Процесс высокопроизводительного скрининга, валидации и направленной эволюции позволяет быстро и экономично превращать белковые биндеры в высококонтрастные нанозонды для фундаментальных исследований, мониторинга окружающей среды, медицинской диагностики и терапии. Результаты опубликованы в Nature Communications.
«Это исследование — многообещающее расширение нашей работы по расширению генетического кода», — сказал ведущий автор исследования Джордж Чёрч, доктор философии, руководитель платформы синтетической биологии Института Висса.
Белок плюс каркас — нанозонд
Команда, возглавляемая Эркином Куру, доктором философии, из группы Чёрча, использовала предыдущее открытие: FgAAs могут превращать известные белковые биндеры в оптические сенсоры, флуоресценция которых включается, когда их FgAA оказывается «зажата» между последовательностью биндера и молекулой-мишенью.
Исследователи сотрудничали с Марком Вендрелем, доктором философии, профессором Эдинбургского университета. Начиная работу во время пандемии, команда сначала сосредоточилась на создании «мгновенного диагностического теста на COVID-19», используя миниатюрное инженерное антитело (нанотело), связывающееся с белком Spike вируса SARS-CoV-2.
Они создали сотни вариантов биндера, в которых FgAAs собирались путем химического связывания аминокислот цистеина или лизина (внедренных в позиции, близкие к мишени) с одним из 20 различных химических флуорогенных каркасов. С помощью простого анализа связывания они отобрали варианты, дающие наибольшее увеличение флуоресценции за миллисекунды при связывании с мишенью.
Затем они использовали тот же процесс для создания нанозондов из нанотел или мини-белков, связывающихся с другими участками SARS-CoV-2, а также с рядом других молекулярных мишеней, включая:
- Рецептор фактора роста EGFR (релевантный для рака)
- Пептид ALFA-tag, используемый клеточными биологами
- Гормон стресса кортизол
Важно, что нанозонды также эффективно сигнализировали о наличии своих мишеней в клетках человека и живых бактериях под микроскопом, демонстрируя свою полезность в качестве инструментов визуализации.
Эволюция нанозондов и платформы 2.0
Первая версия платформы была ограничена трудоемким процессом с множеством этапов очистки. «Мы хотели значительно расширить пространство молекулярного дизайна, увеличив пропускную способность платформы», — сказал Куру.
В версии 2.0 команда предварительно синтезировала «синтетическую аминокислоту» с уже присоединенным флуорогенным каркасом. Чтобы преодолеть препятствие (рибосома не может естественным образом включать такие аминокислоты), они переопределили редко используемый кодон в универсальном генетическом коде с помощью новой химии расширения генетического кода.
«По сути, мы модернизировали процесс синтеза белка для создания активируемых связыванием флуоресцентных нанозондов», — сказал соавтор Джонатан Риттичир, доктор философии, соразработчик метода.
Новый процесс позволил производить миллионы кандидатов в нанозонды одновременно и ускорить их тестирование, поскольку всю синтезированную смесь можно было напрямую комбинировать с мишенью или добавлять в живые клетки без дополнительной очистки. Теперь они могут исследовать сотни вариантов в день, а не несколько десятков за недели.
Подчеркивая мощность усовершенствованной платформы, они обнаружили в исходном нанотеле к SARS-CoV-2 специфическую позицию для встраивания FgAAs, которая, неожиданно, привела к созданию нанозонда с более высоким сродством к белку Spike, чем их оригинальный COVID-19 нанозонд.
Направленная эволюция и новые возможности
Наконец, команда использовала платформу для оптимизации самой последовательности нанотела с помощью классического процесса синтетической биологии — направленной эволюции. Начиная с лучшего нанозонда для обнаружения Spike исходного штамма SARS-CoV-2, они создали обширные библиотеки вариантов нанотел.
Эволюция лучших из них привела к новым нанозондам с на порядки более высоким сродством к белку Spike. Интересно, что, используя модифицированную версию этой системы направленной эволюции, они обнаружили нанозонды, способные селективно обнаруживать различные новые омикрон-варианты.
«Это важный шаг вперед в нашей способности быстро разрабатывать недорогие флуоресцентные биосенсоры для мониторинга заболеваний в реальном времени, с огромным потенциалом для диагностики и прецизионной медицины», — сказал Вендрель.
Куру добавил: «Мы также можем включать синтетические аминокислоты со многими другими функциями во все виды белков для создания новых терапевтических средств и более широкого спектра исследовательских инструментов».
Действительно, Куру и другие авторы вместе с Чёрчем и старшим автором Джеймсом Коллинзом, доктором философии, также начали в Институте Висса проект AminoX, который использует эту платформу для разработки новых методов лечения.
«Эта высокоинновационная работа, позволяющая создать новое, более мощное поколение активируемых связыванием биосенсоров, демонстрирует замечательные возможности синтетической биологии», — сказал Дональд Ингбер, доктор медицины и философии, основатель и директор Института Висса.