Простая технология удешевляет CRISPR-редактирование генов

Исследователи из Калифорнийского университета в Беркли разработали гораздо более дешёвый и простой способ нацеливания инструмента для редактирования генов CRISPR-Cas9 на разрезание или мечение ДНК.

Технология CRISPR-Cas9, изобретённая три года назад в UC Berkeley, произвела революцию в геномике благодаря своей способности находить и разрезать определённую последовательность ДНК, легко инактивируя гены. Это открывает большие перспективы для целевой генной терапии и поиска причин заболеваний.

Технологию также можно модифицировать для связывания без разрезания, метя ДНК флуоресцентным зондом. Это позволяет исследователям отслеживать конкретный ген среди тысяч других в ядре живой делящейся клетки.

Новая разработка значительно упрощает создание РНК-гидов, которые обеспечивают высокую точность нацеливания CRISPR-Cas9. Фактически, менее чем за $100 на материалы можно создать десятки тысяч таких точно нацеленных зондов, покрывающих весь геном организма.

Процесс, названный CRISPR-EATING ("Everything Available Turned Into New Guides"), описан в статье, которая выйдет 10 августа в журнале Developmental Cell.

В качестве доказательства концепции исследователи превратили весь геном кишечной бактерии E. coli в библиотеку из 40 000 РНК-гидов, покрывающую 88% бактериального генома. Каждый РНК-гид представляет собой сегмент из 20 пар оснований РНК — шаблон, который CRISPR-Cas9 использует для поиска комплементарной ДНК для связывания и разрезания.

Такие библиотеки можно использовать в традиционном CRISPR-Cas9 редактировании для нацеливания на любую конкретную последовательность ДНК в геноме и её разрезания. Это позволяет исследовать функцию гена: "выключить" его и наблюдать за последствиями в клетке, что помогает, например, определить причину заболевания. Этот процесс называется генетическим скринингом и проводится партиями: каждый из тысяч зондов вводится в отдельную клетку на планшете с сотнями тысяч клеток.

"Мы можем создавать эти библиотеки за гораздо меньшие деньги, что делает генетический скрининг потенциально доступным для менее изученных организмов", — сказал первый автор статьи Эндрю Лейн, постдокторант UC Berkeley.

Мониторинг клеток в реальном времени

Лейн и его коллега Ребекка Хилд, профессор молекулярной и клеточной биологии UC Berkeley, разработали эту технологию для отслеживания хромосом в реальном времени в живых клетках, в частности во время деления клетки (митоза). Это часть более масштабного проекта Хилд по изучению регуляции размера ядра и других клеточных компонентов в процессе роста организма.

"Эта технология позволит нам "окрасить" целую хромосому, наблюдать за ней вживую в ядре во время клеточного цикла или в процессе развития, например, в эмбрионе, чтобы увидеть, как меняются её размер и структура", — сказала Хилд.

Новая методика использует стандартную ПЦР для генерации множества коротких фрагментов ДНК из интересующего исследователя сегмента, вплоть до целого генома. Затем эти фрагменты точно разрезаются в области PAM, критически важной для связывания CRISPR. Простые рестрикционные ферменты используются, чтобы отрезать каждый кусок на расстоянии 20 пар оснований от конца PAM, создавая РНК-гид точного размера, который CRISPR использует для поиска в геноме комплементарных участков. Эти гиды затем легко встраиваются в комплекс CRISPR-Cas9, давая на выходе десятки тысяч зондов для мечения или разрезания ДНК.

"Используя сам геном в качестве источника РНК-гидов, их подход делает создание библиотек, нацеленных на смежные области, доступным практически для любой лаборатории", — сказал Джейкоб Корн, управляющий и научный директор Инициативы инновационной геномики в UC Berkeley. — "Это может быть очень полезно для визуализации генома и определённых видов скрининга, и мне очень интересно увидеть, как это позволит совершать биологические открытия с помощью инструментов Cas9".