Как получить высококачественную РНК из химически сложных растений
Экстракция РНК — печально известная сложная и чувствительная лабораторная процедура. Новые протоколы, разработанные в Университете Флориды, быстрее, эффективнее и надежнее предыдущих методов.
«Получение чистых и неповрежденных образцов РНК необходимо для секвенирования активных генов, или транскриптома, растения», — объясняет ботаник Ингрид Джордон-Тейден, разработавшая протоколы.
Протоколы в готовом для работы виде с подробными примечаниями и руководством по устранению неполадок опубликованы в недавнем выпуске журнала Applications in Plant Sciences. Наиболее успешный подход сочетает реагент TRIzol и набор TURBO DNA-free от Ambion, Life Technologies, с дополнительными шагами, проверенными исследователями.
«Нам нужно было что-то, что будет стабильно давать РНК хорошего качества для широкого спектра типов растений, — объясняет соавтор Андре Чандербали. — Соединения, такие как флавоноиды, танины, воски и другие вторичные метаболиты, содержащиеся в растительных тканях, могут затруднять экстракцию РНК».
Исследователи работали с разнообразным набором древесных, ароматических и водных растений в рамках участия в крупном международном проекте по секвенированию транскриптома — «Инициатива 1000 растений» (1000 Plants Initiative). Они провели 382 отдельные экстракции РНК, чтобы протестировать различные методики на различных видах растений.
Ключевым компонентом новых протоколов является то же пенообразующее вещество, которое обычно используется в шампунях, — лауроилсаркозинат натрия. Ученые используют его с 1970-х годов, потому что он разрушает жировые клеточные мембраны, высвобождая содержимое клетки.
«В сочетании с TRIzol и набором TURBO саркозил помогает экстрагировать высококачественную РНК в большом количестве из большинства видов растений, — объясняет Джордон-Тейден. — Добавление стадии с CTAB улучшило успешность экстракции даже для самых «упрямых» видов. Однако, несмотря на успех протоколов, наши методы все еще не сработали для некоторых растений, содержащих большое количество слизи».
В лаборатории экстракция РНК печально известна тем, что приводит к мучительным неудачным дням у лабораторного стола. РНК чрезвычайно хрупка и чувствительна к деградации ферментами под названием РНКазы, которые существуют повсюду в природе, включая воздух. Рабочие поверхности должны быть стерилизованы, так как РНКазы могут быстро превратить целые нити РНК в «суп» из нуклеиновых кислот, непригодный для секвенирования.
«Как только мы собираем растительную ткань, например, срез листа, для экстракции РНК, мы мгновенно замораживаем ее в жидком азоте, чтобы предотвратить деградацию, — говорит Джордон-Тейден. — Затем мы измельчаем ее и смешиваем с коктейлем реагентов, после чего отмываем растительные волокна и другие клеточные компоненты. Чем дольше длится процесс, тем выше шансы деградации РНК».
«Плохое качество РНК равнозначно плохому секвенированию транскриптома», — говорит Джордон-Тейден.
Протоколы экстракции прошли долгий путь со времен открытия нуклеиновых кислот, но впереди еще много работы по мере расширения проектов секвенирования. Коммерческие наборы предоставляют готовые ингредиенты и пошаговые инструкции, упрощающие процесс, но по мере того, как все больше лабораторий работает со сложными немодельными видами растений, требуются более совершенные методы экстракции.
Процесс итераций, включающий устранение неполадок в 382 экстракциях и внесение модификаций в коммерческие наборы, послужит ценным ресурсом. Поскольку все больше ботаников исследуют генетическую природу биоразнообразия растений на Земле, эти протоколы предоставят им метод экстракции, способный справиться практически с любым растением.