Улучшенный метод CRISPR позволяет стабильно встраивать крупные гены в ДНК высших растений

Ученые из Института биохимии растений им. Лейбница (IPB) впервые смогли эффективно, стабильно и точно встраивать крупные сегменты генов в ДНК высших растений. Для этого они оптимизировали метод редактирования генов CRISPR/Cas, известный как «генетические ножницы».

Улучшенный метод CRISPR открывает большие возможности для целенаправленной модификации генов высших растений как в селекции, так и в исследованиях. Исследование под руководством профессора Алена Тиссье и доктора Тома Шрайбера опубликовано в журнале Molecular Plant.

Хотя CRISPR/Cas идеально подходит для «нокаута» (отключения или удаления) существующих генов, он плохо работает для точной вставки генов или замены генных сегментов. До сих пор этот метод был слишком неэффективен для целенаправленной вставки генов в ДНК высших растений.

«Причина в собственной ремонтной системе растения для разрывов ДНК», — поясняет Шрайбер. Ремонтные ферменты быстро распознают ровные разрезы, сделанные генетическими ножницами, и немедленно воссоединяют две разорванные цепи двойной спирали ДНК. Этот процесс происходит очень быстро и не очень точно, с небольшими потерями или добавлениями фрагментов ДНК.

«Эти неточности не проблема в проектах по нокауту и даже желательны, — говорит Шрайбер, — но если я хочу вставить ген, это должно быть сделано очень точно. Генетическая информация должна быть вставлена идеально, иначе ген теряет свою функцию».

Чтобы повысить успешность вставки гена, ученые из Галле оснастили генетические ножницы дополнительным ферментом — экзонуклеазой. Экзонуклеазы могут изменять сайты разреза ДНК так, что внутренние ремонтные ферменты клетки больше не могут распознать и исправить повреждение. У сегмента ДНК, который нужно вставить, появляется достаточно времени для интеграции в правильное положение с помощью другого, очень точного клеточного механизма репарации.

В эксперименте ученые протестировали различные экзонуклеазы вирусного, бактериального, растительного и человеческого происхождения на способность увеличивать количество точных событий вставки гена. Они вводили генетические ножницы с соответствующими экзонуклеазами и сегмент гена X в клетки листьев табака Nicotiana benthamiana.

Эти клетки табака были предварительно снабжены геном зеленого флуоресцентного маркера, но также содержали разрушенный ген X, необходимый для образования этого красителя. Флуоресценция появлялась только при точной вставке недостающего участка гена X с помощью CRISPR/Cas, что позволяло подсчитывать успешные события вставки.

Две из протестированных экзонуклеаз, включая одну из семейства вируса герпеса, оказались особенно эффективными. С их помощью команда добилась в 38 раз больше успешных вставок гена, чем с одним только CRISPR/Cas.

Этот подход также был успешно протестирован с другими генами и на других растениях — резуховидке Таля (Arabidopsis thaliana) и пшенице. В Arabidopsis и пшенице ученые стремились встроить ген в клетки зародышевой линии для обеспечения стабильного наследования.

С помощью проверенных экзонуклеаз стабильный (т.е. наследуемый) «нокаут-ин» генов оказался успешным:

• В Arabidopsis — с десятикратным увеличением частоты.
• В пшенице — более чем у 1% растений-потомков.

«Один процент поначалу звучит не так много, — объясняет Шрайбер, — но если селекционер хочет ввести определенный признак в свое растение, с помощью нашего оптимизированного метода CRISPR/Cas ему пришлось бы проанализировать всего около 50–100 растений первого поколения, чтобы найти растение с нужным признаком. Это экономит значительное время по сравнению с традиционными методами селекции, где для этой цели пришлось бы анализировать 500–1000 растений».

Таким образом, оптимизированный метод CRISPR/Cas является многообещающим инструментом для целенаправленной вставки генов в высшие растения и, возможно, в другие организмы. В будущем селекционеры смогут использовать его, например, для возврата утраченных генов устойчивости к патогенам из диких видов или старых сортов в современные высокоурожайные элитные сорта.

Для науки этот подход открывает большие возможности для элегантной замены определенных генов растений их модифицированными копиями за один шаг, что особенно полезно для выяснения функции генов.