Обнаружение клеточных микроРНК с помощью miRacles

МикроРНК (miRNAs) — это короткие некодирующие регуляторные РНК, которые могут подавлять экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, и поэтому их всё чаще используют в качестве биомаркеров заболеваний. Обнаружение miRNAs может быть трудоёмким и дорогостоящим, так как требует амплификации, мечения и радиоактивных зондов. В недавней статье, опубликованной в Science Advances, Арун Ричард Чандрасекаран и его коллеги из RNA Institute и Department of Biological Sciences Университета Олбани (State University of New York) сообщили об одноэтапном, безынзимном анализе для обнаружения микроРНК с использованием конформационно нечувствительных ДНК-нанопереключателей.

Учёные назвали анализ «miRacles» (сокращение от «micro-RNA activated conditional looping of engineered switches»). Анализ продемонстрировал суб-аттомольную чувствительность и однонуклеотидную специфичность с использованием гель-электрофореза в агарозе в качестве метода детекции. В экспериментах они обнаруживали клеточные микроРНК в нанограммовых количествах РНК-экстрактов, полученных из дифференцирующихся мышц. Учёные представили экономичную экспериментальную установку для обнаружения miRNAs в течение часа, что составляет убедительную альтернативу существующим методам количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) и Northern blotting для количественного определения этих регуляторных генетических материалов.

Традиционные методы обнаружения miRNAs включают Northern blotting, количественную ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR), секвенирование нового поколения и гибридизацию на микрочипах для отделения сигнала miRNA от шума. Эти методы часто полагаются на дополнительные методы мечения или поэтапную амплификацию, что увеличивает стоимость, сложность и время анализа.

В данной работе Чандрасекаран и др. разработали относительно простое устройство на основе ДНК для решения сложной биомедицинской задачи. В анализе miRacles учёные использовали «умный реагент», состоящий из рационально сконструированных ДНК-нанопереключателей для простого и экономичного обнаружения нативных miRNA без использования специализированного оборудования в лаборатории.

Принцип работы:

  • Учёные сконструировали ДНК-нанопереключатель в виде линейной дуплексной структуры, которая образует петлю в присутствии целевой молекулы miRNA.
  • Для создания нанопереключателя использовался подход ДНК-оригами путём гибридизации коротких олигонуклеотидов, комплементарных одноцепочечной ДНК-затравке.
  • Были спроектированы две удалённые «детекторные» цепи с выступами, комплементарными разным сегментам целевой miRNA. Когда miRNA связывалась с конструкцией, переключатель переходил из линейного состояния («выключено») в петлеобразное («включено»).
  • Два состояния количественно определяли с помощью стандартного гель-электрофореза в агарозе для детекции сигнала от петлеобразного нанопереключателя.

Результаты:

  1. Высокая специфичность: Анализ продемонстрировал способность различать miRNAs, отличающиеся всего одним нуклеотидом (например, в семействе let-7b), что является ключевой проблемой в детекции miRNA.
  2. Высокая чувствительность: Оптимизация протокола позволила достичь уровня обнаружения от суб-аттомолей до единичных аттомолей для различных miRNAs (let-7b, miR-15a, miR-206).
  3. Обнаружение в биологических образцах: Учёные успешно обнаружили miRNA в нанограммовых количествах тотальной РНК, экстрагированной из дифференцирующихся миобластов (клеток-предшественников мышц). Они показали прогрессивное увеличение экспрессии miR-206 в малых РНК в процессе дифференцировки клеток в течение 1–4 дней.
  4. Мультиплексирование: Используя программируемость нанопереключателей, исследователи разработали систему, способную одновременно обнаруживать несколько miRNAs (miR-206, miR-125b, miR-24, miR-133-3p) из одного образца. Разные петли давали уникальные полосы на геле для точной детекции.

Значение работы:

  • Это первый пример использования ДНК-нанопереключателей для обнаружения miRNAs в реальном биологическом образце.
  • Чувствительность miRacles превосходит Northern blotting и микрочипы.
  • Анализ позволяет измерять miRNAs без необходимости амплификации, с более простыми протоколами и без дополнительных ошибок, связанных с обработкой образца. Протокол сводится к смешиванию нанопереключателей с образцом и проведению гель-электрофореза.
  • Работа соответствует более широкой концепции «экономной науки» (frugal science), предлагая экономичное и доступное решение для обнаружения miRNA, которое потенциально может быть перенесено с биологических на клинические образцы для диагностики и мониторинга заболеваний.