Новый метод «ДНК-шредера» выходит за рамки CRISPR-ножниц

Инструмент CRISPR-Cas9 за последние шесть лет преобразил генетические исследования, позволяя учёным точно вырезать и редактировать участки ДНК, как крошечными ножницами.

Но иногда ножниц недостаточно. Международная команда представила новый CRISPR-инструмент, который действует скорее как шредер, способный стирать длинные участки ДНК в человеческих клетках с программируемой точностью.

В статье в Molecular Cell они описывают, как впервые заставили работать другую CRISPR-Cas систему — Type I CRISPR-Cas3 — в качестве инструмента для редактирования длинных участков ДНК в человеческих клетках.

Этот инструмент позволяет нацеливаться и удалять гораздо более протяжённые участки ДНК, чем это возможно с текущими инструментами на основе Cas9. Эта возможность может быть использована в генетических исследованиях для понимания основ заболеваний и потенциально в терапии болезней, связанных с длинными участками ДНК.

Другой тип CRISPR

Новый инструмент использует Type I CRISPR, который встречается у бактерий гораздо чаще, чем Type II (к которому относится Cas9). Type I CRISPR никогда ранее не использовался в эукариотических клетках. Он использует рибопротеиновый комплекс Cascade для поиска цели и фермент Cas3 для «измельчения» ДНК.

Сложную работу по оптимизации и очистке белков выполнила лаборатория профессора Корнеллского университета Айлонга Кэ, Ph.D., соавтора статьи. Первыми авторами работы стали аспирант Корнелла Адам Долан и старший научный специалист UM Чжунган Хоу, Ph.D.

Исследование включало доставку бактериальных CRISPR-компонентов в виде белков в человеческие эмбриональные стволовые клетки и клетки линии HAP1. С одним CRISPR-гидом команде удалось удалить целевые участки ДНК длиной от нескольких сотен пар оснований до 100 килобаз.

Шредер с мотором

Ян Чжан, Ph.D., ведущий автор исследования из Мичиганского университета, называет систему Cascade-Cas3 «ДНК-шредером с мотором», потому что она может перемещаться вдоль генома на определённое расстояние, разрушая генетический материал по пути.

«Cas9 — это молекулярные ножницы, которые идут куда нужно и делают один разрез. Но Cas3 идёт куда нужно, путешествует по хромосоме и создаёт спектр делеций длиной в десятки килобаз. Это может сделать его мощным инструментом скрининга для определения того, какие большие области ДНК наиболее важны для конкретного заболевания».

Это может быть особенно полезно при изучении некодирующих длинных участков ДНК. Способность Cas3 перемещаться на большое расстояние по хромосоме недоступна для современных методов на основе Cas9. Поэтому «неактивная» версия Cas3, которая может перемещаться по ДНК, но лишена функции разрушения, может стать мощной платформой для доставки при эпигеномном инжиниринге длинных участков.

Научные вызовы

Часть работы включала создание чувствительной двойной репортёрной клеточной линии (Сара Хауден, Ph.D., Мельбурнский университет), чтобы выявить даже низкую активность «шредера» в стволовых клетках.

Другой задачей был анализ результатов «измельчения». Чжунган Хоу разработал метод профилирования на основе транспозазы, а Питер Фреддолино, Ph.D., создал специальные биоинформатические пайплайны для анализа результатов глубокого секвенирования.

Айлонг Кэ отмечает, что поскольку гидовая РНК, необходимая для наведения «шредера», длиннее, чем в системах CRISPR-Cas9, а поиск цели и её деградация — два чётко разделённых этапа, новый метод потенциально лучше контролируется и с меньшей вероятностью будет делать ошибочные разрезы в нецелевых участках.

Перспективы и патент

Этот новый инструмент и его производные могут быть полезны в терапевтических целях, хотя такое применение — дело отдалённого будущего. Существуют опасения по поводу нецелевых редактирований CRISPR-Cas9 в ДНК пациентов, и потребуется дальнейшая работа, чтобы выяснить, позволяет ли подход «шредера» избежать этой проблемы.

Мичиганский и Корнеллский университеты подали заявку на совместный патент на этот новый инструмент. Исследование финансировалось Национальными институтами здравоохранения (NIH) (гранты GM128637, GM118174, GM102543, GM117268) и программой Medical School's Biological Sciences Scholars Program.