Более точные генетические ножницы для биотехнологического инструментария

CRISPR/Cas-система (генетические ножницы) — одна из самых многообещающих технологий для постоянного лечения наследственных заболеваний. Она позволяет целенаправленно разрезать и модифицировать ДНК.

Однако разные варианты генетических ножниц (Cas9-вариации) имеют разную эффективность и не всегда точно режут ДНК в нужном месте.

Исследовательская группа под руководством профессора Тобиаса Канца и доктора Рето Эггеншвилера из Ганноверской медицинской школы нашла способ «заточить» три варианта генетических ножниц и повысить их эффективность. Результаты опубликованы в Nucleic Acids Research.

Как работают ножницы и в чём проблема

CRISPR/Cas9 использует направляющую РНК, чтобы привести фермент Cas9 к определённому месту в ДНК, где он создаёт двуцепочечный разрыв.

Для активации Cas9 требуется специфическая последовательность-метка на ДНК — PAM (protospacer-adjacent motif). У стандартной системы CRISPR/Cas9 PAM-последовательность — NGGN (где N — любая из четырёх нуклеотидных оснований: аденин (A), гуанин (G), цитозин (C), тимин (T)).

Существуют варианты Cas9, которые нацелены на другие PAM-последовательности или почти не требуют их распознавания. Это позволяет резать геном в других местах, но с меньшей эффективностью, чем у стандартной системы.

«Заточка» трёх вариантов Cas9

Команда детально изучила взаимодействие с ДНК трёх таких вариантов и целенаправленно их генетически модифицировала:

1. iSpyMac: Нацелен на NAAN-PAM. Это важно, так как AA — самая распространённая динуклеотидная последовательность в человеческом геноме, что открывает много новых возможностей для редактирования.
2. Cas9-SpRY: Так называемый PAM-free фермент, не требующий строгой PAM-последовательности, что позволяет резать ДНК практически в любом месте.
3. Cas9-SpG: Нацелен на NGNN-PAM, то есть требует всего одного гуанинового нуклеотида (G) в качестве метки.

«С помощью AI-генерации 3D-моделей и компьютерного моделирования мы смогли определить важные структурные области в вариантах Cas9, — объясняет доктор Эггеншвилер. — Затем мы специфически модифицировали ферменты так, что их взаимодействие с ДНК в некоторых целевых участках возросло до четырёх раз».

Улучшенные варианты теперь позволяют проводить более эффективные генетические модификации по всему геному.

Цель: лечение наследственной мутации

С помощью новых ферментов исследователи планируют исправить наследственную генную мутацию, вызывающую дефицит альфа-1-антитрипсина. При этой болезни в организме не хватает защитного белка, что повреждает лёгкие и печень.

«Мы хотим заменить один дефектный нуклеотид на правильный», — говорит соавтор исследования Мика Опиц.

Успех станет шагом к излечению этой серьёзной болезни, конечная стадия которой требует трансплантации лёгкого или печени.